家畜体外育种系统和方法与流程

本发明的领域是家畜胚胎干细胞的衍生和分化。

背景技术：

1、随着世界人口的增加，食物产量也需要增加。然而，最近估计全球家畜生产约占世界温室气体排放量的15％(capper,j.l.和cady,r.a.,j.anim.sci.,2020,98,skz291)。增加食物产量同时最大限度地减少环境影响的一种方法是通过遗传进展—根据动物性能的遗传预测提高动物种质的效率。例如，2007年至2017年间，尽管牛的数量减少了相同数量，但乳制品产量却增加了近25％—即2007年75％的奶牛在2017年的产奶量比2007年增加了25％(capper,j.l.和cady,r.a.,j.anim.sci.,2020,98,skz291)。尽管牛奶产量大幅增加，但效率的提高仅导致温室气体增加1％。(温室气体排放量很快就会开始减少，因为整个乳制品行业已承诺到2050年实现净零碳排放。)遗传改善也推动了猪肉产量的增加；猪肉产量从1959年的121亿磅增加到2009年的228亿磅。同期，猪肉生产用地减少78％，用水量减少41％，并且猪肉生产的碳足迹减少35％。

2、一些综述认为，通过体外育种可以加快乳制品种质的遗传进展—最著名的是goszczynski,d.e.等人.,biology of reproduction,2019,100,885–895。常规育种需要在体外产生胚胎后将胚胎孕育6个月(猪)或9个月(牛)，然后再等待7个月(猪)到一年(牛)以使动物达到性成熟。本方法寻求使用生殖生物学技术来缩短世代时间，从而允许在更短的时间内增加遗传进展。

技术实现思路

1、本发明人已经开发出体外育种家畜(如牛和猪)的方法。在一些实施例中，本教导内容提供了一种家畜育种的方法，其可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：a)从多个成年动物中选择至少一个家畜亲本；b)从至少一个家畜亲本中获得多个配子；c)使用多个配子产生至少一个胚胎；d)从至少一个胚胎产生胚胎干细胞系；e)对至少一个胚胎进行基因分型；f)选择至少一种胚胎干细胞系进行育种；g)诱导来自至少一种所选系的干细胞以分化为配子或配子样细胞；以及h)将配子或配子样细胞与异性配子或配子样细胞组合以产生至少一个下一代胚胎。在一些配置中，对至少一个胚胎进行基因分型可包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：对由至少一个胚胎制备的胚胎干细胞进行基因分型或对至少一个胚胎的活组织切片进行基因分型。在各种配置中，配子或配子样细胞的组合可以通过体外受精或通过卵胞浆内单精子注射来进行。在各种配置中，异性亲本的配子可以来自具有高遗传优点的成年动物，或者配子样细胞来自本教导内容的方法中产生的异性基因型胚胎干细胞系。

2、在各种配置中，本教导内容的方法可以进一步包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：i)从至少一个下一代胚胎产生胚胎干细胞系，以产生下一代胚胎干细胞系；以及j)对下一代胚胎细胞系重复步骤e至h。在各种配置中，该方法可以进一步包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：由根据本教导内容的方法对家畜进行育种时产生的胚胎干细胞系中的至少一者产生动物。在各种配置中，亲本可以是牛亲本或猪亲本。

3、在各种配置中，产生胚胎干细胞系可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：向胚胎、源自其的囊胚或其部分施用wnt信号传导抑制剂、gsk3信号传导抑制剂、端锚聚合酶抑制剂、rho激酶(rock)抑制剂、激活素a信号传导的诱导剂或其组合。在一些配置中，wnt信号传导抑制剂，如果存在的话，可以是iwr-1、iwr-1-endo、iwp-2、box5、icrt3、骨硬化蛋白、dkk2、dkk1、lf3、cct036477、fh535、小豆蔻明、iwp-l6、wnt-c59、氯硝柳胺、xav-939、icg-001、lgk-974、cp21r7、ncb-0846、pnu-74654、盐霉素、ky021 11、wiki4、pri-724、kya1797k、2,4-二氨基-喹唑啉、ant 1.4br、ant 1.40、阿匹枯拉菌素(apicularen)、巴佛洛霉素(bafilomycin)、etc-159、g007-lk、g244-lm、iwr、nsc668036、pkf1 15-584、吡维铵、槲皮素、银线草醇d、bc2059或其组合；gsk3抑制剂，如果存在的话，可以是chir99021、ar-a014418、a 1070722、sb 415286、tcs2002、3f8、tdzd 8、tc-g 24、bio-丙酮肟、靛玉红-3'-肟、tws119、tcs21311、sb 216763、bio、碳酸锂、肯帕罗酮(kenpaullone)、阿特波龙(alsterpaullone)或chir 98014；端锚聚合酶抑制剂，如果存在的话，可以是xav939、az6102、jw 55、tc-e 5001或wiki4；rock抑制剂，如果存在的话，可以是y-27632或pd0325901；并且激活素a信号传导的诱导剂，如果存在的话，可以是激活素a、土木香内酯、bmp4、nodal、stauprimide、sb-431542、a01、土木香内酯、gdf8或长春花碱。在各种配置中，wnt信号传导抑制剂，如果存在的话，可以是iwr-1、iwr-1-endo、iwp-2、box5、icrt3、骨硬化蛋白、dkk2、dkk1、lf3、cct036477、fh535、小豆蔻明、iwp-l6、wnt-c59、氯硝柳胺、xav-939、icg-001、lgk-974、cp21r7、ncb-0846、pnu-74654、盐霉素、ky021 11、wiki4、pri-724、kya1797k、2,4-二氨基-喹唑啉、ant 1.4br、ant 1.40、阿匹枯拉菌素、巴佛洛霉素、etc-159、g007-lk、g244-lm、iwr、nsc668036、pkf115-584、吡维铵、槲皮素、银线草醇d、bc2059或其组合。在各种配置中，gsk3抑制剂，如果存在的话，可以是chir99021、ar-a 014418、a 1070722、sb415286、tcs 2002、3f8、tdzd 8、tc-g 24、bio-丙酮肟、靛玉红-3'-肟、tws119、tcs21311、sb216763、bio、碳酸锂、肯帕罗酮、阿特波龙或chir 98014。在各种配置中，端锚聚合酶抑制剂，如果存在的话，可以是xav939、az 6102、jw 55、tc-e 5001和wiki4；rock抑制剂，如果存在的话，可以是y-27632或pd0325901；并且激活素a信号传导的诱导剂，如果存在的话，是激活素a、土木香内酯、bmp4、nodal、stauprimide、sb-431542、a01、土木香内酯、gdf8或长春花碱。在各种配置中，细胞可以进一步用bfgf、fgf2、fgf4或sun 11602处理。在各种配置中，该方法可以进一步包括向细胞施用：维生素c、lif信号传导的诱导剂或其组合。

4、在各种配置中，将细胞诱导成配子或配子样细胞可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：通过向细胞施用激活素a信号传导的诱导剂、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)信号传导的诱导剂、胰岛素信号传导的诱导剂、wnt信号传导的诱导剂或其组合，来将来自所选的干细胞系中的每一者的细胞诱导成祖细胞。在一些配置中，祖细胞可以是中胚层样细胞，并且诱导可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：在包含激活素a、chir99021和血清替代物的培养基中培养细胞。在各种配置中，祖细胞可以是毛原细胞样细胞，并且诱导可以包括在包含bfgf、激活素a和chir99021的培养基中培养细胞。在各种配置中，将细胞诱导成配子或配子样细胞可以进一步包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：通过向细胞施用bmp信号传导的诱导剂、lif信号传导的诱导剂、scf信号传导的诱导剂、egf信号传导的诱导剂、wnt信号传导的诱导剂或其组合，来将祖细胞诱导成原始生殖细胞样细胞(pgclc)。在一些配置中，将祖细胞诱导成pgclc可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：向细胞施用lif、scf、egf和bmp4。在一些配置中，诱导可以进一步包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：施用血清替代物。

5、在各种配置中，将细胞诱导成配子或配子样细胞可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：通过向细胞施用视黄酸(ra)信号传导的诱导剂、胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)信号传导的诱导剂、睾酮信号传导的诱导剂或其组合，来将胚胎干细胞诱导成精原干细胞样细胞(ssclc)。在各种配置中，将胚胎干细胞诱导成配子或配子样细胞可以包括通过施用胰岛素信号传导的诱导剂、睾酮信号传导的诱导剂、fsh的诱导剂、牛垂体提取物(bpe)或其组合，来将胚胎干细胞诱导成精子细胞。在各种配置中，将细胞诱导成配子或配子样细胞可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：通过以下将胚胎干细胞诱导成卵母细胞：将胚胎干细胞放入重构卵巢中；向重构卵巢中的细胞施用雌激素受体激动剂；向重构卵巢中的细胞施用至少一种tgfβ信号传导的诱导剂；以及向重构卵巢中的细胞施用fsh信号传导的诱导剂、egf信号传导的诱导剂、促性腺激素信号传导的诱导剂或其组合。在各种配置中，将干细胞诱导成配子或配子样细胞可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：通过使细胞表达figla、sohlh1、lhx8、nobox、stat3、tbpl2、dynll1、sub1或其组合，来将干细胞诱导成卵母细胞。

6、在各种实施例中，本教导内容的牛育种方法可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：a)从多个成年动物中选择至少一个牛亲本；b)从至少一个牛亲本中获得多个配子；c)从多个配子产生至少一个胚胎；d)从至少一个胚胎产生一种或多种胚胎干细胞系，其中该产生可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：i)向胚胎、由其成熟的囊胚或其部分施用wnt信号传导抑制剂和fgf信号传导的诱导剂；e)对一种或多种胚胎干细胞系进行基因分型；f)选择干细胞系的组合进行育种；g)诱导来自每种所选系的干细胞以分化成配子或配子样细胞，其中该诱导可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：i)通过施用激活素a信号传导的诱导剂、bfgf信号传导的诱导剂、胰岛素信号传导的诱导剂、wnt信号传导的诱导剂或其组合，来将干细胞诱导成祖细胞；ii)通过施用bmp信号传导的诱导剂、lif信号传导的诱导剂、scf信号传导的诱导剂、egf信号传导的诱导剂、wnt信号传导的诱导剂或其组合，来将祖细胞诱导成pgclc；iii)将具有xy基因型的pgclc诱导成精子细胞样细胞，其可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：a)通过施用ra信号传导的诱导剂、gdnf信号传导的诱导剂、睾酮信号传导的诱导剂或其组合，来将pgclc诱导成ssclc；b)通过施用胰岛素信号传导的诱导剂、睾酮信号传导的诱导剂、fsh信号传导的诱导剂或bpe，来将ssclc诱导成精子细胞样细胞；iv)将具有xx基因型的pgclc诱导成卵母细胞，其可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：a)将细胞放入重构卵巢中；b)向重构卵巢施用雌激素受体激动剂；c)向重构卵巢施用至少一种tgfβ信号传导的诱导剂；d)向重构卵巢施用fsh信号传导的诱导剂、egf信号传导的诱导剂、促性腺激素信号传导的诱导剂或其组合；h)用配子或配子样细胞进行体外受精，以形成多个下一代胚胎；i)从多个下一代胚胎中的每一者产生胚胎干细胞系，以产生下一代胚胎干细胞系；以及j)对下一代胚胎细胞系重复步骤e至h。在一些配置中，步骤d)可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：在包含fgf2和iwr1的培养基中孵育胚胎、由其成熟的囊胚或其部分；步骤g)可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：i)通过施用激活素a、bfgf和chir99021，来将干细胞诱导成毛原细胞，或者通过施用血清替代物、激活素a和chir99021，来将干细胞诱导成中胚层样细胞；ii)通过向细胞施用bmp4、lif、scf、egf和血清替代物，来将毛原细胞或中胚层样细胞诱导成pgclc；iii)将xy pgclc诱导成精子细胞样细胞，其可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：a)通过施用ra、gdnf和睾酮来将pgclc诱导成sscl；b)通过施用血清替代物、睾酮和bpe来将sscl诱导成精子细胞样细胞；iv)将xx pgclc诱导成卵母细胞，其可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：a)将xx pgcls与雌性牛性腺体细胞和ra混合以形成重构卵巢；b)向重构卵巢施用ici182780以诱导次级卵泡样结构(2fl)；c)向2fl施用fsh、bmp15和gdf9以诱导卵丘-卵母细胞复合体(coc)；d)向coc施用fsh、egf和hcg以形成卵母细胞。在各种配置中，该方法可以进一步包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：由在步骤d或步骤i中所产生的胚胎干细胞系中的至少一者产生动物。

7、在各种实施例中，根据本教导内容的猪育种方法可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：a)从多个成年动物中选择至少一个猪亲本；b)从至少一个猪亲本中获得多个配子；c)从多个配子产生至少一个胚胎；d)从至少一个胚胎产生一种或多种胚胎干细胞系，其中该产生可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：i)从多个胚胎中分离出胚胎、由其成熟的囊胚或其部分；以及ii)在补充有gsk3抑制剂、端锚聚合酶抑制剂、维生素c、激活素a信号传导诱导剂、lif信号传导诱导剂、fgf信号传导诱导剂或其组合的培养基中孵育胚胎、由其成熟的囊胚或其部分；e)对一种或多种胚胎干细胞系中的每一者进行基因分型；f)选择干细胞系的组合进行育种；g)诱导来自每种所选系的干细胞以分化成配子样细胞，其中该诱导可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：i)通过向细胞施用激活素a信号传导的诱导剂、bfgf信号传导的诱导剂、胰岛素信号传导的诱导剂、wnt信号传导的诱导剂或其组合，来将干细胞诱导成祖细胞；ii)通过向细胞施用bmp信号传导的诱导剂、lif信号传导的诱导剂、scf信号传导的诱导剂、egf信号传导的诱导剂、wnt信号传导的诱导剂或其组合，来将祖细胞诱导成pgclc；iii)将具有xy基因型的pgclc诱导成精子细胞样细胞，其包括：a)通过向细胞施用ra信号传导的诱导剂、gdnf信号传导的诱导剂、睾酮信号传导的诱导剂或其组合，来将pgclc诱导成ssclc；b)通过向细胞施用胰岛素信号传导的诱导剂、睾酮信号传导的诱导剂、fsh信号传导的诱导剂和bpe，来将ssclc诱导成精子细胞样细胞；iv)将具有xx基因型的pgclc诱导成卵母细胞，其包括：a)将细胞放入重构卵巢中；b)向重构卵巢施用雌激素受体激动剂；c)向重构卵巢施用至少一种tgfβ信号传导的诱导剂；d)向细胞施用fsh信号传导的诱导剂、egf信号传导的诱导剂、促性腺激素信号传导的诱导剂或其组合；h)用配子或配子样细胞进行体外受精，以形成多个下一代胚胎；i)从多个下一代胚胎中的每一者产生胚胎干细胞系，以产生下一代胚胎干细胞系；以及j)对下一代胚胎细胞系重复步骤e至h。在一些配置中，步骤d)可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：向胚胎、由其成熟的囊胚或其部分施用bfgf、chir99021和pd0325901；步骤g)可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：i)通过向细胞施用激活素a、bfgf和chir99021，来将干细胞诱导成毛原细胞，或者通过向细胞施用血清替代物、激活素a和chir99021，来将干细胞诱导成中胚层样细胞；ii)通过施用bmp4、lif、scf、egf和血清替代物，来将毛原细胞或中胚层样细胞诱导成pgclc；iii)将xy pgclc诱导成精子细胞样细胞，其可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：a)通过施用ra、gdnf和睾酮来将pgclc诱导成sscl；b)通过施用血清替代物、睾酮和bpe来将sscl诱导成精子细胞样细胞；iv)将xx pgclc诱导成卵母细胞，其可以包括：a)将xx pgclc与雌性牛性腺体细胞和ra混合以形成重构卵巢；b)向重构卵巢施用ici182780以诱导次级卵泡样结构(2fl)；c)向2fl施用fsh、bmp15和gdf9以诱导coc；d)向coc施用fsh、egf和hcg以形成卵母细胞；e)使卵母细胞成熟为mii卵母细胞。在各种配置中，该方法可以进一步包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：由在步骤d或步骤i中所产生的胚胎干细胞系中的至少一者产生动物。

8、在各种实施例中，本教导内容提供了一种体外生成牛原始生殖细胞样细胞的方法，其可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：向牛胚胎干细胞施用fgf信号传导的诱导剂、激活素a信号传导的诱导剂和wnt信号传导的诱导剂，以诱导牛毛原细胞，或者向牛胚胎干细胞施用激活素a信号传导的诱导剂、wnt信号传导的诱导剂和血清替代物，以诱导牛中胚层样细胞；以及向牛毛原细胞或牛中胚层样细胞施用lif信号传导的诱导剂、scf信号传导的诱导剂、egf信号传导的诱导剂和bmp信号传导的诱导剂，以诱导原始生殖细胞样细胞。在一些配置中，制备牛毛原细胞并且wnt信号传导的诱导剂可以通过抑制gsk3来诱导wnt。在各种配置中，制备牛毛原细胞，并且激活素a信号传导的诱导剂可以是激活素a、土木香内酯、bmp4、nodal、stauprimide、sb-431542、a01、土木香内酯、gdf8或长春花碱，fgf信号传导的诱导剂可以是bfgf、sun 11602、硫糖铝或fgf-p，并且wnt信号传导的诱导剂可以是wnt2b、wnt3a、wnt-4、wnt5a、wnt5b、wnt7a、wnt8a、wnt9a、wnt-9b、wnt10b、wnt11、wnt16b、norrin、wnt激动剂i、wnt激动剂ii、chir99021、lp 922056、bml 284、way 316606盐酸盐、sgc aak1 1、chir 98014或foxy 5。在各种配置中，制备牛中胚层样细胞，并且激活素a信号传导的诱导剂可以是激活素a、土木香内酯、bmp4、nodal、stauprimide、sb-431542、a01、土木香内酯、gdf8或长春花碱，并且wnt信号传导的诱导剂可以是wnt2b、wnt3a、wnt-4、wnt5a、wnt5b、wnt7a、wnt8a、wnt9a、wnt-9b、wnt10b、wnt11、wnt16b、norrin、wnt激动剂i、wnt激动剂ii、chir99021、lp 922056、bml 284、way 316606盐酸盐、sgc aak1 1、chir 98014或foxy5。在一些配置中，lif信号传导的诱导剂可以是lif，scf信号传导的诱导剂可以是scf，并且bmp信号传导的诱导剂可以是bmp4、bmp8b、bmp7、tgfβ、sb4(2-[[(4-溴苯基)甲基]硫代]苯并噁唑)、曲安奈德、异甘草素和km11073、4'-羟基查耳酮或svak-12。

9、在各种实施例中，本教导内容提供了一种从牛胚胎干细胞诱导牛原始生殖细胞样细胞(bpgclc)的方法，其可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：向细胞施用：i)bfgf、激活素a和chir99021，以形成牛毛原细胞；或ii)激活素a、chir99021和血清替代物以形成牛中胚层样细胞；b)向细胞施用rlif、scf、egf、bmp4和血清替代物以产生bpgclc。

10、在一些实施例中，本教导内容提供了一种诱导猪胚胎干细胞的方法，其可以包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：提供胚胎、囊胚或其部分；向胚胎、囊胚或其部分施用：fgf信号传导诱导剂、wnt信号传导诱导剂、rho激酶(rock)抑制剂和激活素a信号传导诱导剂。在一些配置中，fgf信号传导的诱导剂可以是bfgf、sun 11602、硫糖铝或fgf-p，wnt信号传导的诱导剂可以是wnt2b、wnt3a、wnt-4、wnt5a、wnt5b、wnt7a、wnt8a、wnt9a、wnt-9b、wnt10b、wnt11、wnt16b、norrin、wnt激动剂i、wnt激动剂ii、chir99021、lp 922056、bml284、way 316606盐酸盐、sgc aak1 1、chir 98014或foxy 5，rock抑制剂可以是y-27632或pd0325901，并且激活素a信号传导的诱导剂可以是激活素a、土木香内酯、bmp4、nodal、stauprimide、sb-431542、a01、土木香内酯、gdf8或长春花碱。在各种配置中，fgf信号传导的诱导剂可以是bfgf、sun 11602、硫糖铝或fgf-p。在各种配置中，wnt信号传导的诱导剂可以是wnt2b、wnt3a、wnt-4、wnt5a、wnt5b、wnt7a、wnt8a、wnt9a、wnt-9b、wnt10b、wnt11、wnt16b、norrin、wnt激动剂i、wnt激动剂ii、chir99021、lp922056、bml 284、way 316606盐酸盐、sgc aak1 1、chir 98014或foxy 5。在各种配置中，rock抑制剂可以是y-27632或pd0325901。在各种配置中，激活素a信号传导的诱导剂可以是激活素a、土木香内酯、bmp4、nodal、stauprimide、sb-431542、a01、土木香内酯、gdf8或长春花碱。在各种配置中，wnt信号传导的诱导剂可以通过抑制gsk3来诱导wnt。在各种配置中，fgf信号传导的诱导剂可以是bfgf，wnt信号传导的诱导剂可以是chir99021，rock抑制剂可以是pd0325901，并且激活素a信号传导的诱导剂可以是激活素a。

11、在各种实施例中，本教导内容提供了一种培养实验室培育肉类的方法，其可以包括：将本教导内容的胚胎干细胞诱导成肌肉细胞、脂肪细胞、器官细胞或其组合；以及在3维结构上培养肌肉细胞、脂肪细胞、器官细胞或其组合。

12、本教导内容提供了一种家畜育种的方法，其可以包括：a)从多个成年动物中选择至少一个家畜亲本；b)从至少一个家畜亲本中获得多个配子；c)使用多个配子产生多个胚胎；d)从多个胚胎中的两者或更多者产生胚胎干细胞系；e)对多个胚胎中的两者或更多者进行基因分型；f)选择至少一种胚胎干细胞系进行育种；g)诱导来自至少一种所选系的干细胞以分化为配子或配子样细胞；以及h)将配子或配子样细胞与异性配子或配子样细胞组合以产生多个下一代胚胎。

13、在一些配置中，对多个胚胎中的两者或更多者进行基因分型可以包括对由多个胚胎中的两者或更多者制备的胚胎干细胞进行基因分型。在各种配置中，对多个胚胎中的两者或更多者进行基因分型可以包括对多个胚胎中的两者或更多者的活组织切片进行基因分型。在各种配置中，配子或配子样细胞的组合可以通过体外受精来进行。在各种配置中，配子或配子样细胞的组合可以通过卵胞浆内单精子注射来进行。在各种配置中，异性亲本的配子可以来自具有高遗传优点的成年动物。在一些配置中，异性亲本的配子可以来自具有高遗传优点的性成熟动物。在各种配置中，异性亲本的配子样细胞可以是由异性干细胞系产生的配子样细胞。在各种配置中，异性亲本的配子样细胞可以来自在步骤d中产生的异性基因型胚胎干细胞系。在各种配置中，异性亲本的配子样细胞可以来自在步骤g中产生的异性胚胎干细胞系。

14、在各种配置中，本教导内容的方法可以进一步包括：i)从多个下一代胚胎中的每一者产生胚胎干细胞系，以产生下一代胚胎干细胞系；以及j)对下一代胚胎干细胞系重复步骤e至h。在各种配置中，本教导内容的方法可以进一步包括使用来自步骤(c)的胚胎干细胞系之一的胚胎干细胞进行核移植。在各种配置中，本教导内容的方法可以进一步包括使用来自步骤(i)的胚胎干细胞系之一的胚胎干细胞进行核移植。在各种配置中，亲本是牛亲本。在各种配置中，亲本是猪亲本。

15、在各种配置中，产生胚胎干细胞系可以包括：i)从来自多个胚胎的一个胚胎中分离出内细胞团(icm)；以及ii)在补充有wnt信号传导抑制剂的培养基中孵育icm。在一些配置中，wnt信号传导抑制剂可以是iwr-1、iwr-1-endo、iwp-2、box5、icrt3、骨硬化蛋白、dkk2、dkk1、lf3、cct036477、fh535、小豆蔻明、iwp-l6、wnt-c59、氯硝柳胺、xav-939、icg-001、lgk-974、cp21r7、ncb-0846、pnu-74654、盐霉素、ky02111、wiki4、pri-724、kya1797k、2,4-二氨基-喹唑啉、ant 1.4br、ant 1.40、阿匹枯拉菌素、巴佛洛霉素、etc-159、g007-lk、g244-lm、iwr、nsc668036、pkf1 15-584、吡维铵、槲皮素、银线草醇d、bc2059或其组合。在一些配置中，wnt信号传导抑制剂可以是iwr-1或iwr-1-endo。在各种配置中，wnt信号传导抑制剂可以是iwr-1，并且细胞可以进一步用fgf2、fgf4或sun 11602处理。

16、在各种配置中，产生胚胎干细胞系可以包括：i)从来自多个胚胎的一个胚胎中分离出内细胞团(icm)；以及ii)在补充有gsk3抑制剂、端锚聚合酶抑制剂或其组合的培养基中孵育icm。在一些配置中，gsk3抑制剂可以是chir99021、ar-a 014418、a1070722、sb415286、tcs2002、3f8、tdzd 8、tc-g 24、bio-丙酮肟、靛玉红-3'-肟、tws119、tcs21311、sb216763、bio、碳酸锂、肯帕罗酮、阿特波龙或chir 98014。在各种配置中，gsk3抑制剂可以是chir99021。在各种配置中，端锚聚合酶抑制剂可以是xav939、az 6102、jw 55、tc-e 5001或wiki4。在各种配置中，端锚聚合酶抑制剂可以是xav939。在各种配置中，该方法可以进一步包括向细胞施用维生素c、激活素a信号传导的诱导剂、lif信号传导的诱导剂或其组合。

17、在各种配置中，将细胞诱导成配子或配子样细胞可以包括将来自所选干细胞系中的每一者的细胞诱导成外胚层样细胞(epilc)。在各种配置中，将细胞诱导成epilc可以包括向细胞施用激活素a信号传导的诱导剂、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)信号传导的诱导剂、胰岛素信号传导的诱导剂或其组合。在一些配置中，激活素a信号传导的诱导剂可以是激活素a、土木香内酯、bmp4、nodal、stauprimide、sb-431542、a01、土木香内酯、gdf8或长春花碱。在一些配置中，激活素a信号传导的诱导剂可以是激活素a。在各种配置中，bfgf信号传导的诱导剂可以是bfgf、sun 11602、硫糖铝和fgf-p。在一些配置中，bfgf信号传导的诱导剂可以是bfgf。在各种配置中，胰岛素信号传导的诱导剂可以是胰岛素、氯化锌、硝酸锌、溴化锌、硫酸锌、硫酸锌-7水、bpv、bmov、氧钒基罗格列酮、氧钒基海藻糖、氧钒基二甲双胍、氧钒基槲皮素、去甲基菊醌b1和brd 7552。在各种配置中，胰岛素信号传导的诱导剂可以是含有胰岛素的培养基添加剂。在一些配置中，培养基添加剂可以是血清替代物。

18、在各种配置中，将细胞诱导成配子或配子样细胞可以包括将胚胎干细胞诱导成原始生殖细胞样细胞(pgclc)。在一些配置中，诱导包括向细胞施用bmp信号传导的诱导剂、lif信号传导的诱导剂、scf信号传导的诱导剂、egf信号传导的诱导剂、wnt信号传导的诱导剂或其组合。在一些配置中，bmp信号传导的诱导剂可以是bmp4、bmp8b、bmp7、tgfβ、sb4(2-[[(4-溴苯基)甲基]硫代]苯并噁唑)、曲安奈德、异甘草素、km11073、4'-羟基查耳酮或svak-12。在一些配置中，bmp信号传导的诱导剂可以是bmp4、bmp8b或其组合。在各种配置中，lif信号传导的诱导剂可以是lif。在各种配置中，scf信号传导的诱导剂可以是scf。在各种配置中，egf信号传导的诱导剂可以是egf、双调蛋白、epr或hb-egf。在一些配置中，egf信号传导的诱导剂可以是egf。在各种配置中，wnt信号传导的诱导剂可以是wnt2b、wnt3a、wnt-4、wnt5a、wnt5b、wnt7a、wnt8a、wnt9a、wnt-9b、wnt10b、wnt11、wnt16b、norrin、wnt激动剂i、wnt激动剂ii、chir99021、lp 922056、bml 284、way 316606盐酸盐、sgc aak1 1、chir98014或foxy 5。

19、在一些配置中，诱导包括向细胞施用bmp信号传导的诱导剂、lif信号传导的诱导剂、scf信号传导的诱导剂、egf信号传导的诱导剂或其组合。在一些配置中，bmp信号传导的诱导剂可以是bmp4、bmp8b、bmp7、tgfβ、sb4(2-[[(4-溴苯基)甲基]硫代]苯并噁唑)、曲安奈德、异甘草素、km11073、4'-羟基查耳酮或svak-12。在一些配置中，bmp信号传导的诱导剂可以是bmp4、bmp8b或其组合。在各种配置中，lif信号传导的诱导剂可以是lif。在各种配置中，scf信号传导的诱导剂可以是scf。在各种配置中，egf信号传导的诱导剂可以是egf、双调蛋白、epr或hb-egf。在一些配置中，egf信号传导的诱导剂可以是egf。

20、在一些配置中，将细胞诱导成配子或配子样细胞可以包括将胚胎干细胞诱导成精原干细胞样细胞(ssclc)。在一些配置中，诱导可以包括向细胞施用视黄酸(ra)信号传导的诱导剂、胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)信号传导的诱导剂、睾酮信号传导的诱导剂或其组合。在一些配置中，视黄酸信号传导诱导剂可以是视黄酸、视黄酸对羟基苯胺、9-顺式视黄酸、bmp4、ttnpb、烯虫酯酸、ec23、1-甲基-2-吲哚酮、阿达帕林、cd437、ac261066、cd1530、ch 55、am 580、am 80、ac 55649、bms 961、bms 753、cd 2314、芬维a胺、阿达帕林、ec 19或sr 1078。在一些配置中，视黄酸信号传导的诱导剂可以是视黄酸。在各种配置中，gdnf信号传导的诱导剂可以是gdnf、神经秩蛋白(nrtn)、神经鞘胚素(artn)、波斯芬(persephin)(pspn)、xib4035、bt13、bt18或bt44。在一些配置中，gdnf信号传导的诱导剂可以是gdnf。在各种配置中，睾酮信号传导的诱导剂可以是睾酮、甲基睾酮、氟甲睾酮、羟甲烯龙、氧甲氢龙、乙雌烯醇、司坦唑醇、达那唑、美雄酮、诺乙雄龙、gdnf、二氢睾酮或淫羊藿苷。

21、在各种配置中，将胚胎干细胞诱导成配子或配子样细胞可以包括将胚胎干细胞诱导成精子细胞。在各种配置中，诱导细胞可以包括施用胰岛素信号传导的诱导剂、睾酮信号传导的诱导剂、fsh信号传导的诱导剂、牛垂体提取物(bpe)或其组合。在各种配置中，胰岛素信号传导的诱导剂可以是胰岛素、bpv、bmov、氧钒基罗格列酮、氧钒基海藻糖、氧钒基二甲双胍、氧钒基槲皮素、去甲基菊醌b1和brd 7552。在各种配置中，胰岛素信号传导的诱导剂可以是胰岛素。在各种配置中，睾酮信号传导的诱导剂可以是睾酮、gdnf、二氢睾酮和淫羊藿苷。在各种配置中，睾酮信号传导的诱导剂可以是睾酮。在各种配置中，fsh信号传导的诱导剂选自由以下项组成的组：fsh、依诺娃(corifollitropin alfa)、fshβ-ctp-α、n2-αfsh、孕马血清促性腺激素、噻唑烷酮和六氢喹啉。

22、在各种配置中，将细胞诱导成配子或配子样细胞可以包括将胚胎干细胞诱导成卵母细胞。在一些配置中，将胚胎干细胞诱导成卵母细胞可以包括将胚胎干细胞放入重构卵巢中。在各种配置中，将胚胎干细胞诱导成卵母细胞可以包括向细胞施用雌激素受体激动剂。在一些配置中，雌激素受体可以是ici182780、阿魏苷(ferutinin)、雌酮硫酸酯哌嗪、雌酮-3-硫酸酯、s-雌马酚、way-200070、dy 131、gsk 4716、ab-1、erb-041、鹰嘴豆芽素a、β-雌二醇、α-雌二醇、ppt、dpn、ferb 033或ac 186。在各种配置中，雌激素受体激动剂可以是ici182780。在各种配置中，诱导可以包括向细胞施用至少一种tgfβ信号传导的诱导剂。在一些配置中，至少一种tgfβ信号传导的诱导剂可以选自由以下项组成的组：bmp15、bmp4、bmp8b、bmp7、gdf9、tgfβ、sb4(2-[[(4-溴苯基)甲基]硫代]苯并噁唑)、曲安奈德、异甘草素、km11073、pd07824、4'-羟基查耳酮或svak-12。在一些配置中，至少一种tgfβ信号传导的诱导剂可以是bmp15、gdf9或其组合。在各种配置中，将细胞诱导成卵母细胞可以包括向细胞施用fsh信号传导的诱导剂、egf信号传导的诱导剂、促性腺激素信号传导的诱导剂或其组合。在一些配置中，fsh信号传导的诱导剂可以是fsh、依诺娃、fshβ-ctp-α、n2-αfsh、孕马血清促性腺激素、噻唑烷酮或六氢喹啉。在一些配置中，fsh信号传导的诱导剂可以是fsh。在各种配置中，egf信号传导的诱导剂可以是egf、双调蛋白、epr和hb-egf。在一些配置中，egf信号传导的诱导剂可以是egf。在各种配置中，促性腺激素信号传导的诱导剂可以是hcg、绒毛膜促性腺激素、绒毛膜促性腺激素α或依诺娃。在一些配置中，egf信号传导的诱导剂可以是egf。

23、在各种配置中，诱导可以包括使细胞表达figla、sohlh1、lhx8、nobox、stat3、tbpl2、dynll1或sub1基因或其组合。在一些配置中，使细胞表达基因可以包括将包含基因的载体瞬时转染到细胞中。

24、在各种配置中，将esc诱导成直接诱导的卵母细胞样细胞的方法可以包括使细胞表达figla、sohlh1、lhx8、nobox、stat3、tbpl2、dynll1或sub1基因或其组合。在各种配置中，使细胞表达基因可以包括将包含基因的载体瞬时转染到细胞中。

25、在各种实施例中，根据本教导内容的牛育种方法可以包括：a)从多个成年动物中选择至少一个牛亲本；b)从至少一个牛亲本中获得多个配子；c)从多个配子产生多个胚胎；d)从多个胚胎中的每一者产生胚胎干细胞系，其中该产生可以包括：i)任选地从来自多个胚胎的胚胎中分离出icm；以及ii)在补充有wnt信号传导抑制剂的培养基中孵育icm；e)对每个胚胎干细胞系进行基因分型；f)选择干细胞系的组合进行育种；g)诱导来自每种所选系的干细胞以分化成配子样细胞，其中该诱导可以包括：i)通过施用激活素a信号传导的诱导剂、bfgf信号传导的诱导剂、胰岛素信号传导的诱导剂或其组合，来将干细胞诱导成epilc；ii)通过施用bmp信号传导的诱导剂、lif信号传导的诱导剂、scf信号传导的诱导剂、egf信号传导的诱导剂、wnt信号传导的诱导剂或其组合，来将epilc诱导成pgclc；iii)将具有xy基因型的pgclc诱导成精子细胞样细胞，其包括：a)通过施用ra信号传导的诱导剂、gdnf信号传导的诱导剂、睾酮信号传导的诱导剂或其组合，来将pgclc诱导成ssclc；b)通过施用胰岛素信号传导的诱导剂、睾酮信号传导的诱导剂、fsh信号传导的诱导剂或bpe，来将ssclc诱导成精子细胞样细胞；iv)将具有xx基因型的pgclc诱导成卵母细胞，其包括：a)将细胞放入重构卵巢中；b)向重构卵巢施用雌激素受体激动剂；c)向重构卵巢施用至少一种tgfβ信号传导的诱导剂；d)向重构卵巢施用fsh信号传导的诱导剂、egf信号传导的诱导剂、促性腺激素信号传导的诱导剂或其组合；h)用配子或配子样细胞进行体外受精，以形成多个下一代胚胎；i)从多个下一代胚胎中的每一者产生胚胎干细胞系，以产生下一代胚胎干细胞系；以及j)对下一代胚胎细胞系重复步骤e至h。在一些配置中，步骤d)可以包括在包含fgf2和iwr1的培养基中孵育icm、胚胎、囊胚或其部分；步骤g)可以包括：i)通过施用激活素a、bfgf和血清替代物，来将干细胞诱导成epilc；ii)通过施用bmp4、lif、scf、bmp8b和egf，来将epilc诱导成pgclc；iii)将xy pgclc诱导成精子细胞样细胞，其包括：a)通过施用ra、gdnf和睾酮来将pgclc诱导成sscl；b)通过施用血清替代物、睾酮和bpe来将sscl诱导成精子细胞样细胞；iv)将xx pgclc诱导成卵母细胞，其包括：a)将xx pgcls与雌性牛性腺体细胞和ra混合以形成重构卵巢；b)向重构卵巢施用ici182780以诱导次级卵泡样结构(2fl)；c)向2fl施用fsh、bmp15和gdf9以诱导卵丘-卵母细胞复合体(coc)；d)向coc施用fsh、egf和hcg以形成卵母细胞。在各种实施例中，该方法可以进一步包括使用来自在步骤d或步骤i中产生的胚胎干细胞系中的至少一者的细胞进行核移植。

26、在各种实施例中，根据本教导内容的猪育种方法可以包括：a)从多个成年动物中选择至少一个猪亲本；b)从至少一个猪亲本中获得多个配子；c)从多个配子产生多个胚胎；d)从多个胚胎中的每一者产生胚胎干细胞系，其中该产生包括：i)任选地从来自多个胚胎的胚胎中分离出icm；以及ii)在补充有gsk3抑制剂、端锚聚合酶抑制剂、维生素c、激活素a信号传导诱导剂、lif信号传导诱导剂或其组合的培养基中孵育icm或胚胎、由其成熟的囊胚或其部分；e)对每个胚胎干细胞系进行基因分型；f)选择干细胞系的组合进行育种；g)诱导来自每种所选系的干细胞以分化成配子样细胞，其中该诱导包括：i)通过向细胞施用激活素a信号传导的诱导剂、bfgf信号传导的诱导剂、胰岛素信号传导的诱导剂或其组合，来将干细胞诱导成epilc；ii)通过向细胞施用bmp信号传导的诱导剂、lif信号传导的诱导剂、scf信号传导的诱导剂、egf信号传导的诱导剂、wnt信号传导的诱导剂或其组合，来将epilc诱导成pgclc；iii)将具有xy基因型的pgclc诱导成精子细胞样细胞，其包括：a)通过向细胞施用ra信号传导的诱导剂、gdnf信号传导的诱导剂、睾酮信号传导的诱导剂或其组合，来将pgclc诱导成ssclc；b)通过向细胞施用胰岛素信号传导的诱导剂、睾酮信号传导的诱导剂、fsh信号传导的诱导剂和bpe，来将ssclc诱导成精子细胞样细胞；iv)将具有xx基因型的pgclc诱导成卵母细胞，其包括：a)将细胞放入重构卵巢中；b)向重构卵巢施用雌激素受体激动剂；c)向重构卵巢施用至少一种tgfβ信号传导的诱导剂；d)向细胞施用fsh信号传导的诱导剂、egf信号传导的诱导剂和促性腺激素信号传导的诱导剂；h)用配子或配子样细胞进行体外受精，以形成多个下一代胚胎；i)从多个下一代胚胎中的每一者产生胚胎干细胞系，以产生下一代胚胎干细胞系；以及j)对下一代胚胎细胞系重复步骤e至h。在一些配置中，步骤d)可以包括在包含chir99021、wh-4-023、xav939、维生素c、激活素a和lif的培养基中孵育icm；步骤g)可以包括：i)通过施用激活素a、bfgf和血清替代物，来将干细胞诱导成epilc；ii)通过施用bmp4、lif、scf、bmp8b和egf，来将epilc诱导成pgclc；iii)将xy pgclc诱导成精子细胞，其包括：a)通过施用ra、gdnf和睾酮来将pgclc诱导成sscl；b)通过施用血清替代物、睾酮和bpe来将sscl诱导成精子细胞；iv)将xx pgclc诱导成卵母细胞，其包括：a)将xx pgclc与雌性牛性腺体细胞和ra混合以形成重构卵巢；b)向重构卵巢施用ici182780以诱导次级卵泡样结构(2fl)；c)向2fl施用fsh、bmp15和gdf9以诱导coc；d)向coc施用fsh、egf和hcg以形成卵母细胞；e)使卵母细胞成熟为mii卵母细胞。在各种配置中，该方法可以进一步包括使用来自在步骤d或步骤i中产生的胚胎干细胞系中的至少一者的细胞进行核移植。