一种麒麟菜突变体库的构建方法及其应用

1.本发明属于海洋生物育种技术领域，具体涉及一种麒麟菜突变体库的构建方法及其应用。


背景技术：

2.麒麟菜（eucheuma denticulatum）是麒麟菜属中重要的养殖品种，由许多圆柱形分枝组成，分枝逐渐变细至锐尖。作为提取卡拉胶的原料来源，麒麟菜已经成为重要的经济海藻。
3.目前，麒麟菜的养殖均以营养繁殖的方式进行，缺乏野生种质资源的补充，导致养殖群体遗传多样性低，环境适应性下降，产量逐年萎缩。所以非常有必要建立麒麟菜的突变体库，改善麒麟菜的种质，使其更好地适应环境，提高产量。然而，现有技术中并没有关于麒麟菜突变体库的构建方法和相关的研究工作报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种麒麟菜突变体库的构建方法及其应用，采用本发明所述的构建方法可以获得大量不同表型的麒麟菜藻体，为麒麟菜的遗传学研究和育种提供突变株材料。
5.本发明提供了一种麒麟菜突变体库的构建方法，包括如下步骤：
6.以常压室温等离子体对麒麟菜藻尖进行诱变处理，得到麒麟菜诱变藻尖；
7.将所述麒麟菜诱变藻尖进行暗处理后，进行第一培养；
8.以80%致死率的诱变条件对所述第一培养的过程中的麒麟菜诱变藻尖进行筛选，得到的存活突变株为麒麟菜突变亲代；
9.将所述麒麟菜突变亲代进行第二培养，长出的侧枝上的藻尖为所述麒麟菜突变体库中的藻体。
10.优选的，所述诱变处理采用常压室温等离子体育种诱变仪进行，所述常压室温等离子体育种诱变仪的功率为300~380w，气量为10~20slm，所述诱变处理的时间为25min；所述常压室温等离子体育种诱变仪的发射器与所述麒麟菜藻尖的距离为2~5mm。
11.优选的，所述暗处理的时间为12~48h，温度为24~30℃。
12.优选的，所述第一培养和第二培养的条件均包括：温度为26℃，光周期为12l：12d，光照强度为50μmol
·
m-2
·
s-1
。
13.优选的，所述麒麟菜藻尖的长度为1~2mm。
14.优选的，所述对麒麟菜藻尖进行诱变处理为将所述麒麟菜藻尖在湿润环境下进行所述诱变处理。
15.优选的，所述湿润环境由蘸有海水的吸水纸提供，所述麒麟菜藻尖位于所述吸水纸上。
16.优选的，所述藻体的长度为1~2mm。
17.本发明还提供了上述技术方案所述的构建方法在麒麟菜育种和/或麒麟菜遗传学研究中的应用。
18.有益效果：
19.本发明提供了一种麒麟菜突变体库的构建方法，包括如下步骤：以常压室温等离子体对麒麟菜藻尖进行诱变处理，得到麒麟菜诱变藻尖；将所述麒麟菜诱变藻尖进行暗处理后，进行第一培养；以80%致死率的诱变条件对所述第一培养的过程中的麒麟菜诱变藻尖进行筛选，得到的存活突变株为麒麟菜突变亲代；将所述麒麟菜突变亲代进行第二培养，长出的侧枝上的藻尖为所述麒麟菜突变体库中的藻体。本发明以常压室温等离子体（atmospheric room temperature plasma，artp）为诱变源对麒麟菜藻尖进行诱变，结合所述筛选条件，以存活藻体新生侧枝上的藻尖来构建麒麟菜突变体库，获得一系列突变率高，遗传变异丰富的种质资源，为麒麟菜育种及遗传研究提供基础材料。
20.同时，与野生型麒麟菜相比，采用本发明构建方法获得的麒麟菜突变藻体侧枝数多，生长速率快，产量更高；干物质含量更高，经济价值得到提升。另外，本发明的构建方法还能够得到色素突变体，为麒麟菜颜色性状位点的解析控制提供了很好的材料。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
22.图1为实施例1和对比例1~5中的诱变处理累积死亡率图；
23.图2为测试例2中翠绿色色素突变体展示图；
24.图3为测试例2中绛紫色色素突变体展示图；
25.图4为测试例2中黄绿色色素突变体展示图；
26.图5为测试例2中红褐色野生麒麟菜展示图；
27.图6为测试例2中第一株极多侧枝突变体展示图；
28.图7为测试例2中第二株极多侧枝突变体展示图。
29.其中图2~7中的比例尺均为1cm。
具体实施方式
30.本发明提供了一种麒麟菜突变体库的构建方法，包括如下步骤：
31.以常压室温等离子体对麒麟菜藻尖进行诱变处理，得到麒麟菜诱变藻尖；
32.将所述麒麟菜诱变藻尖进行暗处理后，进行第一培养；
33.以80%致死率的诱变条件对所述第一培养的过程中的麒麟菜诱变藻尖进行筛选，得到的存活突变株为麒麟菜突变亲代；
34.将所述麒麟菜突变亲代进行第二培养，长出的侧枝上的藻尖为所述麒麟菜突变体库中的藻体。
35.以常压室温等离子体对麒麟菜藻尖进行诱变处理，得到麒麟菜诱变藻尖。本发明所述麒麟菜藻尖的长度优选为1~2mm，更优选为2mm。本发明对所述藻尖的宽度和厚度没有特殊限定，保持麒麟菜的原始宽度和厚度即可。本发明优选将所述麒麟菜藻尖在湿润环境下进行所述诱变处理，所述湿润环境优选由蘸有海水的吸水纸提供，所述麒麟菜藻尖优选
位于所述吸水纸上；所述湿润环境可以使麒麟菜藻尖保持湿润，避免藻体离水时间过长所导致的状态不佳或死亡。
36.本发明优选使用常压室温等离子体诱变育种仪进行所述诱变处理，所述常压室温等离子体诱变育种仪的型号和来源没有特殊限定，采用本领域中常规常压室温等离子体诱变育种仪即可。本发明所述诱变处理的功率优选为300~380w，更优选为360w；所述诱变处理的气量优选为10~20slm，更优选为15slm；所述诱变处理的距离优选为2~5mm，更优选为2mm，所述距离为所述麒麟菜藻尖距离常压室温等离子体诱变育种仪的发射器的距离；所述诱变处理的时间优选为25min。
37.得到所述麒麟菜诱变藻尖后，本发明将所述麒麟菜诱变藻尖进行暗处理。本发明所述暗处理的时间优选为12~48h，更优选为24h；所述暗处理的温度优选为24~30℃，更优选为26℃。本发明所述暗处理的作用为：避免藻尖诱变后由于光损伤而死亡。
38.所述暗处理后，本发明将所述暗处理后的麒麟菜诱变藻尖进行第一培养。本发明所述第一培养的温度优选为26℃；所述培养的光周期优选为12l：12d；所述培养的光照强度优选为50μmol
·
m-2
·
s-1
。
39.所述第一培养的过程中，本发明以80%致死率的诱变条件对所述第一培养的过程中的麒麟菜诱变藻尖进行筛选，得到的存活突变株为麒麟菜突变亲代。本发明优选从所述培养的第1天开始，每2天统计所述麒麟菜诱变藻尖的死亡率，直至所述麒麟菜诱变藻尖的累积死亡率达到80%且稳定，得到的存活突变株为麒麟菜突变亲代。
40.得到所述麒麟菜突变亲代后，本发明将所述麒麟菜突变亲代进行第二培养，长出的侧枝上的藻尖为所述麒麟菜突变体库中的藻体。本发明所述第二培养的条件优选与所述第一培养的条件相同，在此不再进行赘述。本发明所述藻体优选为从所述侧枝上切下的藻尖，所述藻体的长度优选为2mm。
41.采用本发明所述构建方法可以得到一系列突变率高，表型丰富的麒麟菜藻体，如侧枝数多，生长速率快的麒麟菜藻体、干物质含量高的麒麟菜藻体以及麒麟菜色素突变体，组成的麒麟菜突变体库遗传变异丰富，为麒麟菜的遗传学研究和育种提供种质资源。
42.基于上述优势，本发明还提供了上述技术方案所述的构建方法在麒麟菜育种和/或麒麟菜遗传学研究中的应用。本发明所述麒麟菜遗传学研究优选包括基因功能验证、解析性状和基因定位。
43.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
44.实施例1
45.一种麒麟菜突变体库的构建方法，步骤如下：
46.1）选择3000个麒麟菜藻尖进行处理，将一层吸水纸蘸海水后铺于载盘上，将麒麟菜藻尖切成2mm大小置于纸上，保证诱变过程中藻尖的湿润；
47.2）将artp诱变育种仪诱变功率设置为360w，气量设置为15slm，藻尖距离常压室温等离子体发射器2mm，诱变时间设置为25min；
48.3）诱变结束后，将步骤2）得到的藻尖26℃情况下暗处理24h；然后在温度26℃，光照强度50μmol
·
m-2
·
s-1
，光照周期12h：12h（l：d）的条件下培养；
49.4）从培养的第1天开始，每2天统计藻尖死亡率，计算累积死亡率，并进行显著性检
验；
50.第n天累积死亡率=n天内总死亡个体数/总突变个体数
×
100%；
51.5）从第1天至第9天，随着天数增加，藻尖累积死亡数提高，直至稳定；6）以80%的致死率为标准，得到的存活个体记为麒麟菜突变亲代；
52.将麒麟菜突变亲代继续培养，培养条件同步骤3）中的培养条件，等到亲代个体长出新的侧枝后，从侧枝顶端切下2mm长的藻尖，并记为第一代，以第一代作为麒麟菜突变体库中的藻体。
53.对比例1
54.采用实施例1中的构建方法进行麒麟菜突变体库的构建，区别在于，不含有步骤6），步骤2）中的诱变时间设置为10min。
55.对比例2
56.采用实施例1中的构建方法进行麒麟菜突变体库的构建，区别在于，不含有步骤6），步骤2）中的诱变时间设置为15min。
57.对比例3
58.采用实施例1中的构建方法进行麒麟菜突变体库的构建，区别在于，不含有步骤6），步骤2）中的诱变时间设置为20min。
59.对比例4
60.采用实施例1中的构建方法进行麒麟菜突变体库的构建，区别在于，不含有步骤6），步骤2）中的诱变时间设置为30min。
61.对比例5
62.采用实施例1中的构建方法进行麒麟菜突变体库的构建，区别在于，不含有步骤6），步骤2）中的诱变时间设置为35min。
63.测试例1
64.对实施例1和对比例1~5中步骤5）中的致死率进行统计，结果如图1所示。由图1可以得出：在麒麟菜突变株的累积死亡数不再提高，进入稳定期后，实施例1中诱变处理25min约为80%的致死率，且为尖端死亡率稳定后的致死率，诱变处理10min、15min、20min、30min和35min的致死率依次约为29.2%、54.2%、66.7%、95.8%和100%，实施例1中诱变处理25min的致死率与20min（对比例3）及30min（对比例4）均具有显著性差异，诱变处理35min的藻尖全部白化死亡。由此可以得出：本发明实施例1中25min的诱变时间可以保证一定的突变率，建立质量较高的突变体库。
65.测试例2
66.对实施例1构建的麒麟菜突变体库中的突变体进行质量评价，步骤如下：
67.麒麟菜突变体库共得到1000株藻体（存活的麒麟菜均可以产生多个分枝），从麒麟菜突变体库中随机取102株突变株组成突变组，随机取102株野生株组成野生组，将突变组和野生组切1cm尖端，在温度26℃，光照强度50μmol
·
m-2
·
s-1
，光照周期12h：12h（l：d）的培养条件下培养3天：
68.测定特定生长率（specific growth rate，sgr），单位厘米侧枝数，干物质含量，最大光合效率（maximum ps
ⅱꢀ
quantum yield，fv/fm），非光化学淬灭（non-photonchemical quenching，npq）参数，计算方法如下：
69.特定生长率=ln(w
t-w0)/t
×
100%, 其中，w0为第0天的重量，w
t
为培养t天后的重量，t为培养时间（天）；
70.单位厘米侧枝数（个/cm）=侧枝数/藻体长度；
71.干物质含量（%）=干重（含水量为0）/鲜重
×
100%；
72.光合生理参数的测定方法：将藻尖置于六孔板，暗适应10min后，使用封闭式叶绿素荧光仪fluorcam mf180（psi，捷克）测定荧光淬灭曲线（quenching curve），得到fv/fm及npq数值；
73.标准差法确定判别界限：，xb表示判别界限，
µ
和σ分别是对照组的平均值和标准差，z
α
/2是标准正态分布的双侧100
ɑ
百分位点，取整数2；
74.突变率（%）=（有效突变株数/总株数）
×
100%，有效突变株数为大于x
b (+)或小于x
b (-)的突变株个数；
75.标准差系数=标准差/平均值；代表数据的离散程度，用以描述表型的丰富程度，并以表1中统计的表型差异数据进行突变率及标准差系数的计算，结果如表1和表2所示。
76.表1 野生组中102株野生株及突变组中102株突变株各表型差异
[0077][0078]
表2 突变组的突变率及标准差系数
[0079][0080]
由表1和表2可以得出：突变组中特定生长率突变株有35株，突变率为34.31%，标准差系数为0.516；单位厘米侧枝数突变株有31株，突变率为30.39%，标准差系数为0.496；干物质含量突变株有27株，突变率为26.47%，标准差系数为0.128；fv/fm突变株有30株，突变率为29.41%，标准差系数为0.095；npq突变株有36株，突变率为35.29%，标准差系数为0.438；
[0081]
另外，突变组中共有色素突变体5株，分别为翠绿色，绛紫色，绛紫色，黄绿色，黄绿色，如图2~4所示，图5为红褐色野生麒麟菜；得到极多枝突变体两株，单位厘米侧枝数多于10个，如图6~7所示，其中图6为第一株极多侧枝突变体展示图，图7为第二株极多侧枝突变体展示图。
[0082]
由以上结果可以得出：本发明所建立的麒麟菜突变体库突变率较高，遗传变异较为丰富，为麒麟菜的遗传育种工作奠定了坚实的基础。
[0083]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。