一种用于构建Ⅱ型糖尿病、高血脂血症斑马鱼模型的方法及应用与流程

本发明属于生物模型构建领域，具体涉及一种用于构建ⅱ型糖尿病、高血脂血症斑马鱼模型的方法及应用。

背景技术：

1、高血脂、高血压、高血糖并称“三高”，三者之间关系密切，相互影响，并且相互加重，是心脑血管疾病的罪魁祸首。其中，糖尿病特征是患者的血糖长期高于标准值，是机体内一个独立存在的病理改变；ⅱ型糖尿病是最常见的糖尿病类型，占糖尿病总数的90％以上；这些代谢性疾病严重影响到患者的生活及身体健康。

2、目前，越来越多的研究者投身于开发和利用可重复的动物模型来评估用于治疗糖尿病、高血脂等这些代谢性疾病。斑马鱼模型就是一个典型的例子。斑马鱼原产于喜马拉雅山南麓的印度、巴基斯坦、孟加拉和尼泊尔等南亚国家，是一种热带淡水鱼。成鱼体长3-4cm，略呈纺锤形，头小而稍尖，吻较短，身躯玲珑而纤细，因其体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝色与银色相间的条纹而得名。一方面，斑马鱼基因和信号通路与人类高度保守(大于85％)，且拥有与人相似的组织器官和系统。另一方面，斑马鱼的生理、发育和代谢过程与哺乳动物高度相似，美国国立卫生研究院(nih)将斑马鱼列为继小鼠和大鼠之后的第三大脊椎模式生物；是目前唯一适于高通量药物筛选的脊椎类动物模型。该模型已被广泛用于体内研究，包括糖尿病、心血管疾病、氧化应激、黑色素瘤、免疫系统和癌症等。具有个体小、发育周期短(24h器官便可形成)、实验周期短(筛选结果在一周内即可得出)、费用低(约为鼠类的1/10-1/100)、体外受精、受精卵及幼鱼透明(可直接观察药物对内部器官的作用)、单次产卵数较高(150-200枚)以及实验用药量小(为小鼠用药量的1/100-1/1000)等优点。斑马鱼模型既具有体外实验快速、高效、费用低等优势，又具有哺乳类动物实验预测性强、可比度高等优点，可以有效弥补体外实验和哺乳类动物实验之间的巨大生物学断层，完善现有药物研发体系。将斑马鱼模型，可以从整体上缩短药物临床前早期研发的实验周期，降低实验成本，提高实验预测的准确性，进而提高药物研发效率，降低药物研发风险。

3、但现有斑马鱼模型组造模疾病单一；且构建的斑马鱼模型存在不稳定、成本高、适应性差等问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种用于构建ⅱ型糖尿病、高血脂血症斑马鱼模型的方法及其应用，解决现有斑马鱼模型造模疾病单一、不稳定、时间长、成本高等问题。本发明方法能够同时构建ⅱ型糖尿病、高血脂血症斑马鱼模型。通过采用特定饲料及方法，可有效诱导斑马鱼血糖、血脂升高，建立的斑马鱼模型相较于现有模型具有稳定性好、维持时间久、成本相对低等优势。

2、本发明具体技术方案如下：

3、一种用于构建ⅱ型糖尿病、高血脂血症斑马鱼模型的方法，具体是通过给予高糖高脂饲料构建ⅱ型糖尿病、高血脂血症斑马鱼模型；

4、所述的高糖高脂饲料是由高糖饲料和高脂饲料混合制备获得的；

5、其中，高脂饲料由干燥蛋黄粉制备获得的；所述的高糖饲料为质量浓度为0.50-3％的葡萄糖工作液；

6、所述方法构建的斑马鱼模型死亡率为0％。

7、优选的，上述高糖高脂饲料中的高脂饲料由如下方法制备获得：

8、a.剔除次蛋、劣蛋、破损蛋，挑选新鲜完整的鸡蛋；用棕刷刷洗鸡蛋壳表面后，用清水冲净感染的菌类和污物；

9、b.将晾干后的鸡蛋放入氢氧化钠水溶液中浸渍，消毒后取出再晾干；

10、c.将蛋清与蛋黄分离，蛋黄液搅拌均匀，用10-30目筛布过滤除去蛋膜、系带及其它杂质，再用巴氏消毒器60-70℃低温消毒；

11、d.将消毒后的蛋黄液与清水按照质量体积比为1：1-3混合，喷雾干燥得到干燥蛋黄粉；

12、e临用前用胚胎营养液将干燥蛋黄粉稀释成质量浓度为0.05-0.15％的高脂饲料，现配现用。

13、优选的，上述高糖高脂饲料中的高糖饲料是由葡萄糖用胚胎营养液配成的质量浓度为0.5-3％工作液，现配现用。

14、胚胎培养液配方具体如下：

15、表1配方

16、

17、注：溶液1、2、3、4配制完成后置于4℃条件下可保存1个月。

18、优选的，上述高糖高脂饲料是高糖、高脂饲料混合后获得的混合饲料；混合饲料中葡萄糖质量浓度为0.50-3％，蛋黄粉质量浓度0.05-0.15％。

19、优选的，步骤d中喷雾干燥条件为：干燥室进风温度设置为170-240℃，出风温度控制在60-75℃。

20、优选的，步骤d中喷雾干燥条件为：干燥室进风温度设置为170-230℃，出风温度控制在60-70℃。

21、本发明中的高糖高脂饲料能够同时诱导斑马鱼血糖、血脂升高。

22、一种用于构建ⅱ型糖尿病、高血脂血症斑马鱼模型的方法，具体的构建步骤如下：

23、(1)斑马幼鱼获取

24、将3～6个月大小、性成熟的野生型斑马鱼进行繁殖，繁殖后的鱼卵，移入胚胎培养液中培养，鱼卵破壳成为幼鱼；

25、(2)取同等数量的斑马鱼放置于空白组、阳性对照、高脂模型组、高糖模型组、高脂高糖模型组中；

26、空白组斑马鱼给予胚胎培养液；

27、高脂模型组给予蛋黄粉质量浓度为0.05-0.15％的高脂饲料；

28、高糖模型组给予葡萄糖质量浓度为0.50-3％的高糖饲料；

29、高脂高糖模型组给予含葡萄糖质量浓度为0.50-3％、蛋黄粉质量浓度为0.05-0.15％的高脂高糖饲料；

30、降糖药阳性对照组给予含葡萄糖质量浓度为0.50-3％、蛋黄粉质量浓度为0.05-0.15％的高脂高糖饲料，再添加盐酸吡格列酮使溶液中盐酸吡格列酮终浓度为15μg/ml；

31、降脂药阳性对照组给予含葡萄糖质量浓度为0.50-3％、蛋黄粉质量浓度为0.05-0.15％的高脂高糖饲料，再添加阿托伐他汀钙使溶液中阿托伐他汀钙终浓度为15μg/ml；

32、恒温箱中26-29℃连续培养6-7天，获得高糖、高脂斑马鱼模型。

33、本发明所提供的用于构建ⅱ型糖尿病、高血脂血症斑马鱼模型的方法所构建的ⅱ型糖尿病、高血脂血症斑马鱼模型能够应用在高血糖、高血脂病例机制研究中。

34、本发明所提供的用于构建ⅱ型糖尿病、高血脂血症斑马鱼模型的方法所构建的ⅱ型糖尿病、高血脂血症斑马鱼模型能够同时使斑马鱼血糖、血脂升高，可应用于评价治疗ⅱ型糖尿病和高血脂药物的作用。

35、本发明的有益效果在于：

36、(1)提供了一种同时构建ⅱ型糖尿病、高血脂血症斑马鱼模型的方法，能快速(6-7天)、有效的构建ⅱ型糖尿病、高血脂血症斑马鱼模型；经试验验证，该方法构建斑马鱼模型，最大程度上的还原了ⅱ型糖尿病和高血脂的物理致病条件——高糖高脂的饮食；在不引入其他不良影响因素的条件下，能够快速、有效、便捷的升高斑马鱼体内的血糖、血脂水平；

37、(2)采用蛋黄粉作为高脂饲料，与高糖饲料共同制备的高糖高脂饲料，可使ⅱ型糖尿病、高血脂血症斑马鱼模型稳定性极好，斑马鱼的死亡率为0％；

38、(3)本发明饲料溶解性高，不会产生普通饲料容易沉底的现象，适口性强，幼鱼更容易进食；

39、(4)成本低。本发明所述的高脂高糖饲料原料简单，组分少，能够在很大程度上节约成本。