一种卵巢细胞冷冻液和解冻液及其制备方法与流程

本发明涉及生物材料，尤其涉及一种卵巢细胞冷冻液和解冻液及其制备方法。

背景技术：

1、卵巢细胞在冷冻的过程中，由于其具有大的尺寸继而具有大量的水分，卵巢细胞可能会受到损坏，进而降低其低温冻存存活率。另外卵巢细胞组成复杂，各部分的热导率和热容不均匀，很难在解冻过程中实现均匀传热，解冻过程的冰晶重结晶后会对细胞造成很大的损伤。

2、卵巢细胞在冷冻和解冻过程中，选择合适的冷冻保护剂能减弱冰晶和高浓度溶质对卵巢细胞的损害，提高卵子存活率，现有技术中的卵巢冷冻采用的冷冻保护剂大多含有血清、二甲基亚砜dmso或两者的组合等，这些冷冻保护剂可使溶液冰点降低，进而提高细胞膜对水的通透性，减少细胞内冰晶的形成，从而避免卵巢细胞的损伤。

3、其中，dmso能够快速穿透卵巢细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时减少卵巢细胞内冰晶的形成，从而避免卵巢细胞损伤，但dmso对细胞存在一定的毒性，不使用dmso，寻找其他替代物也显得尤为必要。

4、冷冻保护剂成分通常还包含血清，然而即使是纯化的白蛋白，由于其动物来源的特性，仍然会极大增加带来病毒等感染物质的可能，同时血清来源受限，价格昂贵，所以其使用也必然会受到越来越多的限制。因此，寻找替代血清的非渗透性保护剂显得尤为必要。

5、现有技术的冷冻液中一般单独使用血清或者dmso，或者使用少量的dmso，但是同时不含有血清和dmso的冷冻液，且能达到类似或更高存活率效果的冷冻液却非常少见。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种卵巢细胞冷冻液和解冻液及其制备方法，通过不使用dmso和血清制备冷冻液和解冻液，解决了现有技术中由于使用dmso或血清，导致可能的病毒污染以及增加对卵巢细胞潜在的毒性作用风险的问题。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明第一方面提供了一种卵巢细胞冷冻液和解冻液的制备方法，所述冷冻液和解冻液的制备步骤包括：

4、（1）将0.5g～8g 聚乙烯醇在70℃～80℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30～40ml缓冲液中，冷却至室温后得到第一溶液；

5、（2）将2 g～5g全甲基化环糊精超声溶解于20m～30ml的缓冲液中，待所述全甲基化环糊精全部溶解后，加入0.05 g～0.2g金纳米笼，超声振荡后，得到第二溶液；

6、（3）将第一溶液和第二溶液混合后加入5ml～8ml的乙二醇，然后调节ph值至7，并定容补足余量缓冲液至100ml，得到冷冻液；

7、（4）将0.5 g～8g的聚乙烯醇在70℃～80℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到20～40ml缓冲液中，冷却至室温后加入0.05 g～0.2g金纳米笼，超声振荡后，然后调节ph值至7，并定容补足余量缓冲液至100ml，得到解冻液。

8、根据本公开的至少一个实施方式，所述全甲基化环糊精为α-全甲基化环糊精、β-全甲基化环糊精或γ-全甲基化环糊精中的一种，所述全甲基化环糊精具有直径为0.5nm～1.5nm且高度为3 nm～4nm的孔洞。

9、根据本公开的至少一个实施方式，所述金纳米笼为立方体纳米颗粒，所述立方体纳米颗粒的表面带有孔洞，所述金纳米笼的粒径为20 nm～80nm，优选为30 nm～60nm，更优选为40 nm～50nm。

10、根据本公开的至少一个实施方式，所述聚乙烯醇的分子量为550 kda～650kda。

11、相对于现有技术，本发明实施例提供的卵巢细胞冷冻液和解冻液的制备方法，通过将0.5g～8g聚乙烯醇溶解到缓冲液中得到第一溶液，而将2 g～5g全甲基化环糊精、0.05g～0.2g的金纳米笼加入到缓冲液中形成第二溶液，然后将第一溶液和第二溶液混合后再加入5ml～8ml的乙二醇调节ph值至7从而得到无dmso或血清的冷冻液。其中，金纳米笼悬浮于冷冻液中，不与冷冻液中的其他成分发生化学反应，无毒副作用，也不会进入卵巢细胞内部，且金纳米笼可有效抑制冰的重结晶，能够提高细胞低温冻存的存活率。另外，全甲基化环糊精和金纳米笼均能提高卵巢细胞存活率，且两者共同使用可以起到协同作用，在冷冻液中同时加入上述两种物质进而避免使用dmso和血清，降低了其毒性以及易带入寄生性生物污染物的风险。

12、本发明实施例解冻液也能够避免使用dmso和血清，将聚乙烯醇加入缓冲液后再加入金纳米笼然后调节ph值至中性，也具有抑制冰晶生长的作用。综上，本发明实施例的冷冻液和解冻液能有效控制冰晶生长，显著改善解冻过程中对卵巢细胞的损害，能达到或优于现有的冷冻解冻液的存活率，且生物相容性好。

13、本发明的另一目的在于还提供一种卵巢细胞冷冻液和解冻液，根据上述的冷冻液和解冻液制备方法制备而得，其中，每100ml冷冻液中包括0.5 g～8g的聚乙烯醇、2 g～5g全甲基化环糊精、0.05 g～0.2g金纳米笼、5ml～8ml的乙二醇，余量为pbs缓冲液；

14、每100ml解冻液中包括0.5 g～8g的聚乙烯醇、0.05 g～0.2g金纳米笼，余量为pbs缓冲液。

15、所述卵巢细胞冷冻液和解冻液相对于现有技术的优势与上述卵巢细胞冷冻液和解冻液制备方法相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。

16、本发明的另一目的在于还提供一种激光加温解冻的方法，采用上述的制备方法制备的冷冻液和解冻液，对所述冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温，同时通过近红外激光进行照射，之后转移到平衡液中平衡2min～6min中完成所述卵巢细胞的解冻。

17、根据本公开的至少一个实施方式，在对所述冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温，同时通过近红外激光进行照射的步骤中，解冻复温的时间为10s～13s。

18、根据本公开的至少一个实施方式，对所述冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温，同时通过近红外激光进行照射的步骤中，所述近红外激光的波长为650 nm～850nm。

19、根据本公开的至少一个实施方式，所述转移到平衡液中平衡2min～6min中完成所述卵巢细胞的解冻的步骤中，所述平衡液的制备步骤至少包括：

20、将0.5 g～8g的聚乙烯醇在70℃～80℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30～40ml的pbs缓冲液中，待所述聚乙烯醇全部溶解后，加入5ml～10ml的乙二醇，调节ph值至7，并定容补足余量pbs缓冲液至100ml，得到平衡液。

21、所述激光加温解冻的方法相对于现有技术的优势与上述制备方法相对于现有技术所具有的优势相同外，还在于对冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温的步骤中同时使用红外激光进行照射含有金纳米笼的解冻液，在解冻过程中利用红外激光照射金纳米笼可以提高升温速率，实现对卵巢细胞的超快速解冻处理，从而提高冷冻卵巢细胞的存活率。

技术特征：

1.一种卵巢细胞冷冻液和解冻液的制备方法，其特征在于，所述冷冻液和解冻液的制备步骤包括：

2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述全甲基化环糊精为α-全甲基化环糊精、β-全甲基化环糊精或γ-全甲基化环糊精中的一种或多种，所述全甲基化环糊精具有直径为0.5nm～1.5nm且高度为3 nm～4nm的孔洞。

3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述金纳米笼为立方体纳米颗粒，所述立方体纳米颗粒的表面带有孔洞，所述金纳米笼的粒径为20 nm～80nm。

4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯醇的分子量为550 kda～650kda。

5. 一种卵巢细胞冷冻液和解冻液，其特征在于，根据权利要求1-4任一项所述的制备方法制备而得，其中，每100ml冷冻液中包括0.5 g～8g的聚乙烯醇、2 g～5g全甲基化环糊精、0.05 g～0.2g金纳米笼、5ml～8ml的乙二醇，余量为pbs缓冲液；

6.一种激光加温解冻的方法，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述的制备方法制备的冷冻液和解冻液，对所述冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温，同时通过近红外激光进行照射，之后转移到平衡液中平衡2min～6min中完成所述卵巢细胞的解冻。

7.根据权利要求6所述的激光加温解冻的方法，其特征在于，在对所述冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温，同时通过近红外激光进行照射的步骤中，解冻复温的时间为10s～13s。

8. 根据权利要求6所述的激光加温解冻的方法，其特征在于，对所述冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温，同时通过近红外激光进行照射的步骤中，所述近红外激光的波长为650 nm～850nm。

9.根据权利要求6-8任一项所述的激光加温解冻的方法，其特征在于，所述转移到平衡液中平衡2min～6min中完成所述卵巢细胞的解冻的步骤中，所述平衡液的制备步骤至少包括：

技术总结
本发明提供了一种卵巢细胞冷冻液和解冻液及其制备方法，属于生物材料技术领域。以解决由于使用DMSO或血清，导致可能的病毒污染技术问题。制备方法包括：将聚乙烯醇水浴中加热，并磁力搅拌下加入到缓冲液中，冷却至室温后得到第一溶液；将全甲基化环糊精超声溶解于的缓冲液中，待全甲基化环糊精全部溶解后，加入金纳米笼，超声振荡后，得到第二溶液；将第一溶液和第二溶液混合后加入的乙二醇，并定容补足余量缓冲液至100ml，得到冷冻液；将的聚乙烯醇在水浴中加热，并磁力搅拌下加入到缓冲液中，冷却至室温后加入0.05 g～0.2g金纳米笼，超声振荡后，调节pH值至7，并定容补足余量缓冲液至100ml，得到解冻液。

技术研发人员：马士卉,程涛,刘利军,马艺戈,韩星星,李玥
受保护的技术使用者：细胞生态海河实验室
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13