细胞冻存液的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种细胞冻存液，可用于间充质干细胞或者其他细胞的低温冻存。所述的干细胞冻存液包含以下成分：主体成份为PBS或生理盐水，或基础培养基，添加成分为聚乙二醇、丙二醇、依克多因、白蛋白、海澡糖、脯氨酸和泊洛沙姆188中的一种或几种。本发明的干细胞冻存液不含有血清和DMSO，添加成份明确，质量可控，批次间稳定性高，安全性高。使用该干细胞冻存液保存细胞，细胞复苏后存活率高，细胞形态，增殖能力和分化潜能不受影响。可用于替代含血清和DMSO的冻存液。
【专利说明】
细胞冻存液
技术领域
[0001 ]本发明涉及细胞及生物工程领域，具体是一种细胞冻存液。
【背景技术】
[0002] 干细胞由于具有自我更新和多向分化的潜能，已经被广泛应用于科学研究和临床 治疗。如胚胎干细胞，诱导多能性干细胞以及间充质干细胞等。干细胞具有多种用途和功 能，可用于在体外研究组织器官的生长发育，建立疾病模型，药物筛选，亦可用于临床治疗。 干细胞中的间充质干细胞已经被广泛用于动物疾病模型的治疗研究和人体临床实验。间充 质干细胞可治疗的疾病包括糖尿病，肝硬化，皮肤损伤，心肌梗死，以及神损伤等疾病。除此 之外间充质干细胞还具有促进造血和进行免疫调节等功能。目前在世界范围内已经有干细 胞药物产品上市。随着科技的发展，干细胞会更有效和广泛的用于各种疾病的治疗，以弥补 传统药物治疗对于某些疾病效果不佳的不足。正常的细胞在体外培养时会不停生长分裂从 而导致最终衰老和功能丧失。像癌细胞以及其它永生化的细胞即使能够无限生长，以不间 断的培养方式保存也会造成过高的培养成本以及细菌和病原体污染的可能性。为了保护， 合理有效利用以及备份足够量的细胞资源，人们需要将有用细胞种子资源保存起来以供日 后的方便使用，以及在需要时用于科学研究和临床治疗。
[0003] 目前细胞的常温保存技术并不成熟，细胞保存广泛采用低温冷冻的保存方式。细 胞的低温保存需要添加冷冻保护剂，如果直接冷冻细胞内会产生冰晶对细胞造成伤害从而 导致细胞死亡。冷冻保护剂包括渗透型冷冻保护剂和非渗透型冷冻保护剂。其中渗透型冷 冻保护剂是细胞保存必须使用的，包括二甲基亚砜(DMS0)、甘油、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙 醇、丙醇、和甲酰胺等。渗透型冷冻保护剂能够穿过细胞膜渗透到细胞内，其中最常用的就 是DMSO AMSO是一种水溶性的极性化合物，在科研和药学领域常用来溶解有机物和小分子 化合物，甚至对无机盐也能溶解。液态的DMSO能高度缔合，具有很强的吸水性和对组织细胞 的渗透性。DMSO能够渗透到细胞内增大胞内渗透压，降低冰点，延缓冻存过程。在缓慢冷冻 过程中，能使细胞中部分水分在冻结前透出细胞。使细胞脱水到可耐受程度，防止细胞内离 子过度浓缩，减少冷冻降温过程中胞内冰晶形成以保护细胞不受冷冻损伤。DMSO含有两个 甲基，甲基的空间阻碍可以有效地抑制DMSO分子间的相互作用，但其能够与水分子发生氢 键作用，正是这些氢键的存在才减弱了DMSO水溶液中冰晶形成的相变驱动力，从而增强了 DMSO对溶液中冰晶形成的抑制效果。
[0004] DMSO是细胞保存中最常用的冷冻剂，但它对细胞也存在一定的毒性，常温下能使 胞内蛋白变性。DMSO导致的不良反应在动物实验中已被证实。在一些临床治疗案例中，注射 了含有DMSO的造血干细胞的病人表现出恶心、头痛、高血压、腹泻和腹部绞痛等症状。因此 对于临床治疗的细胞保存应该尽量减少DMSO的用量，或将其替换为一种更安全的冷冻保护 剂。
[0005] 非渗透型冷冻保护剂包括:聚乙烯吡咯烷酮，糖类如海藻糖，庶糖，乳糖，葡萄糖， 糖醇如露醇和山梨醇，另外还有羟乙基淀粉等。羟乙基淀粉能增加细胞内渗透压，主要在细 胞冷冻的初始阶段使细胞内水部分水分排出，从而减少细胞内冰晶的形成。海藻糖能与细 胞膜发生相互作用，在冻存和复苏过程中稳定膜蛋白结构，海藻糖能形成玻璃态基质减少 细胞外部形成的冰晶对细胞造成的伤害。
[0006] 血清是细胞冻存常用的胞外保护剂，使用血清冻存的细胞存活率高，效果较好，通 常的细胞冻存液中都含有血清，浓度从5 %到90 %不等。血清能稳定细胞膜，缓冲和保护细 胞，调整细胞内渗透压，减少在冻存和长期储存过程中活性氧自基对细胞造成的伤害。其中 最常用的血清就是胎牛血清(FBS，fetal bovine serm)。然而动物来源的血清存在感染病 毒病菌等病原体的风险，而且其中的一些蛋白质可能会导致免疫排斥反应。除此之外，血清 存在批次之间差异和不稳定性等问题。因此，对于临床使用的细胞保存应该避免使用血清， 采用更安全的血清替代物。
[0007] 本发明中的冻存液不含有DMSO和血清，该冻存液成分明确，安全稳定，可重复性 好。干细胞在冻存和复苏后，形态与冻存前一致，存活率高，增殖能力良好，分化潜能够不受 影响。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对现有技术的不足，开发出一种较安全稳定的无DMSO无血清冻 存液。
[0009] 为了实现上述要求和目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0010] 一种无DMSO无血清冻存液。所述的冻存液包含以下成分:主体成份为PBS或生理盐 水，或基础培养基，添加成分为聚乙二醇、丙二醇、Ectoin(依克多因，耐盐菌萃取液）、白蛋 白、海澡糖、脯氨酸和Poloxamer 188(泊洛沙姆188);
[0011]添加成分为如下化合物或其中部分化合物，浓度如下：
[0013]~~添加物质中的聚乙二醇能降低冰点
，促进细胞脱水。丙二醇和Ectoin具有很强的 水分子络合能力，功能与DMSO相似减少冷冻过程中细胞内冰晶的形成。脯氨酸也能渗透到 细胞中发挥类似的作用。白蛋白对细胞具有缓冲和保护的作用。海藻糖能与细胞膜发生相 互作用，在冻存和复苏过程中稳定膜蛋白结构，海藻糖能形成玻璃态基质减少细胞外部形 成的冰晶对细胞造成的伤害。Poloxamer 188是一种细胞膜稳定剂，另外研究发现它也能够 抑制细胞凋亡相关基因的表达。本发明冻存液中添加的聚乙二醇、丙二醇、白蛋白、海澡糖、 脯氨酸和P 〇 1 〇 X a m e r 18 8，都已经被应用于食品和药品加工领域，可获得临床级的药品。 Ectoin也是一种对人体无害的物质，是一种广泛应用的化妆品添加剂。因此采用上述化合 物组合配制成的细胞冻存液，对人体无毒无害，可用于临床级别的细胞保存。
[0014] 本发明的优点：
[0015] 1.细胞冻存的效果良好，不亚于使用DMSO和血清冻存的效果。
[0016] 2.不含有DMSO和血清，成分明确，更安全稳定。
【附图说明】
[0017] 图IA:冻存前的细胞形态，细胞融合达到90 %。
[0018] 图1B:使用90%血清10%DMS0冻存的细胞复苏24h后的细胞形态。
[0019]图1C:使用无血清无DMSO冻存液冻存的细胞复苏24h后的细胞形态，与图IB中的细 胞形态无明显差异。
[0020] 图2:细胞复苏后的存活率。采用无血清无DMSO冻存液冻存细胞30天，复苏后存活 率为87.9 ±2.79% ;采用90%血清10%DMS0冻存细胞30天，细胞复苏后存活率为86.3 土 2.75%。
[0021] 图3:细胞经无血清无DMSO冻存液(实心圆形折线）和90 %血清10 % DMSO(实心方形 折线)冻存30天后，复苏培养的生长曲线。第0天接种细胞数量均为1万个/孔(6孔板）。经过7 天培养后，使用无血清无DMSO冻存液冻存过的细胞收获细胞数量(40±2.3)X10 5个;使用 90%血清10%DMS0冻存过的细胞收获细胞数量(37.7±3.5)X105个。
[0022]图4:流式检测结果。对使用无血清无DMSO冻存液冻存的脐带间充质干细胞进行流 式检测，其中⑶73，⑶105，⑶90，CD44和⑶29阳性率大于95 %，⑶34，⑶45和HLA-Dr阳性率小 于2 %，从流式结果来看，本方法分离培养得到的细胞符合MSC鉴定标准。
[0023]图5A:无血清无DMSO冻存液冻存的间充质干细胞复苏后向成骨细胞分化结果。细 胞表面已经被茜素红染色液染成深红色，说明细胞已经向胞外分泌骨基质，说明细胞具有 成骨分化潜能。
[0024]图5B:无血清无DMSO冻存液冻存的间充质干细胞复苏后向脂肪细胞分化结果。细 胞中存在大量脂肪滴被油红氧染成红色，说明细胞具有脂肪分化潜能。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和具体实施例，对本发明做进一步详细说明。
[0026] 实施例1:
[0027]基础成份为D/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12))基础培养基，添加成分如下：
[0029] 实施例2:
[0030] 基础成份为D/Fl 2基础培养基，添加成分如下： [0032] 实施例3:
[0033]基础成份为D/F12基础培养基，添加成分如下：
[0035] 实施例4:
[0036] 基础成份为D/F12基础培养基，添加成分如下：
[0038] 实施例5:
[0039] 基础成份为D/F12基础培养基，添加成分如下：
L〇〇63」对比实验冻存液：
[0064] 90 % FBS+10 % DMSO的冻存液被用做本发明的对比实验冻存液。
[0065] 细胞复苏
[0066]将细胞从液氮罐中取出，迅速转移到37 °C水浴锅中放置2min，经PBS洗涤后接种到 培养皿中培养。
[0067] 细胞培养和冻存
[0068] 本发明测试用的细胞为本公司长期保存的原代脐带间充质干细胞，使用的无血清 培养基为Coming? stemgro?hMSC Medium(货号：40-410-KIT)，培养条件为37°C、5%C〇2培 养箱。细胞复苏后，加入5ml PBS洗涤细胞，200g离心弃上清，补充适量培养基重悬细胞以 5000个细胞/cm2的密度接种培养。待细胞融合度达80-90%时，用0.05%的胰酶消化，经洗 涤200g离心后，继续以5000个细胞/cm 2的密度传代培养。经培养到第3代融合度达到80-90 %时，用0.05 %的胰蛋白酶消化细胞，经200g离心和PBS洗涤后分别使用本发明冻存液和 有血清冻存液进行冷冻保存。冻存体系为IO6个细胞/0.5ml冻存液，使用两种冻存液各冻存 10管细胞，将细胞转到冻存管后放置4°C冰箱中保存lh，然后放置-80°C超低温冰箱过夜保 存，第二天转移到液氮中长期保存，30天后复苏检测。
[0069] 形态学观察
[0070]在细胞冻之前和复苏后24h，从培养箱中取出培养皿，放置在倒置显微镜下观察并 拍照记录。
[0071 ]细胞计数和存活率检测
[0072] 将细胞用培养基稀释到2X106/ml浓度，吸取10μ1细胞悬液和10μ1 0.4%苔盼蓝溶 液充分混合后加入到上样载玻片中，然后使用CountStar细胞计数仪进行计数和存活率检 测。
[0073] 细胞生长曲线
[0074]细胞复苏洗涤后，用适量培养基重悬细胞。向6孔板中每孔加入2ml细胞悬液(含 10000个活细胞），放置37°C，5%C02培养箱中培养7天，每3天换液。每隔24小时取3孔细胞进 行消化计数，取3孔平均值。连续检测7天。将检测结果绘制成脐带间充质干细胞生长曲线。 [0075]流式检测
[0076] 细胞复苏后培养到80-90%融合度时进行流式检测。准备消化好的代脐带间充质 干细胞，PBS洗涤后对细胞进行抗体标记，标记抗体分别是PE-CD73，PE-CD105，PE-CD90，PE-CD34，FITC-CD45,FITC-HLA-Dr，PE-CD44，PE-CD29,PE-Mouse IgGl和FITC-Mouse IgGl(抗 体采购自BD bioscience)。经孵育洗涤后，上机检测。
[0077] 成骨细胞和脂肪细胞分化
[0078] 将复苏后的细胞培养到80-90%融合度后，消化传代进行成骨和成脂细胞分化。脐 带MSC向成骨细胞和脂肪细胞分化采用Gibco的成骨细胞分化和脂肪细胞分化试剂盒，货号 分别是A10072-01，A10070-01。实验操作按说明书要求进行。
【主权项】
1. 一种细胞冻存液，包含W下组分及含量： 主体成份为PBS或生理盐水，或基础培养基， 添加成分为聚乙二醇、丙二醇、依克多因、白蛋白、海澡糖、脯氨酸和泊洛沙姆188中的 一种或几种； 所述添加成分在冻存液中浓度如下： 中文名 浓度 聚石二醇 0.1-10% (w/v) 丙二醇 0.1-30% (v/v) 依克多因 0.1-30% (w/v) 白蛋白 0.1-10% (w/v) 海藻糖 化1-10% (W/V) 脯氨酸 0.1-10% (w/v) 泊洛沙姆1能 0.:0的-1% :(保知） 。2. 如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征是:所述基础培养基为D/F12基础培养基。
【文档编号】A01N1/02GK105961374SQ201610517331
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】刘聪, 黄馨萍, 陈晨, 魏志璋, 罗晓玲
【申请人】深圳市合康生物科技股份有限公司, 深圳市合一康生物科技股份有限公司