父源性睾丸发育不良动物模型的构建方法、干预靶标及其应用

本发明涉及动物模型构建，具体涉及一种父源性睾丸发育不良动物模型的构建方法、干预靶标及其应用。

背景技术：

1、睾丸发育不良是指各种因素导致睾丸没有发育或发育不完全，是一种日益常见且与环境有关的雄性生殖系统发育障碍性疾病，其主要包括隐睾、尿道下裂、低精子质量、睾丸癌等睾丸发育不良状态。睾丸发育不良的已知起因主要包括先天与后天因素。其中先天因素主要是由染色体异常引起的，多见青春期发育延迟，男性第二性征不明显，乳房增大等女性化表现，人群的发病率是1000-1500分之一；后天因素主要包括感染、外伤以及内分泌异常等。睾丸发育不良易诱发男性不育症发生、心血管疾病等，基于流行病学调查，大约15％的夫妇受到不孕不育症的影响，男性因素被认为在50％的不孕夫妇中起作用，并且是20％不孕不育症的唯一病因。目前随着环境污染、社会压力、慢性应激等外界因素的加剧，男性睾丸发育不良的发病率逐年升高，并且尚未存在有效的治疗手段，这可能与睾丸发育不良的病因和临床表现复杂、多样有关。

2、近年来，“健康与疾病的发育起源(dohad)”学说目前已受到研究人员的广泛关注[1]。例如，母体孕期暴露于尼古丁、酒精会导致雄性子代肛殖距缩短，男性胎儿出现女性化特征；孕期某些药物使用(如人工合成类糖皮质激素、非甾体抗炎药等)可导致子代睾丸睾酮合成功能抑制。目前多数研究睾丸发育不良模型均集中于母体不良环境暴露所致[2,3]。然而，近期随着“健康与疾病的父系起源(pohad)”学说的兴起，越来越多的证据支持父体不良环境暴露可致子代睾丸发育不良[4]。如父体孕前双酚a和镉等重金属暴露会导致子代出现精子数量减少、精子质量降低[5,6]。目前，虽然部分睾丸发育不良综合征模型已得到广泛应用，如睾丸生精细胞中atg5/atg7敲除的小鼠表现出少精、无精症，但是仍然没有模型能完全模拟睾丸发育不良并反映其发生发展过程。因此，为了补充与扩展睾丸发育不良模型的范围，迫切需要父源性睾丸发育不良模型的建立与应用，进一步探究其发病机制、早期预警与防治，从而造福人类。

3、咖啡因是一种黄嘌呤生物碱，广泛存在于咖啡、茶、能量饮料、食物和止痛药物中，临床上可作为治疗早产儿呼吸暂停的辅助药物[7]。流行病学调查发现男性咖啡因暴露的现状较女性更为严重，并且有年轻化的趋势。根据美国国家健康和营养调查数据，育龄男性咖啡因平均摄入量为240mg/d，约为女性的1.5倍，最高可达300mg/d[8-10]。本发明前期系统研究发现，母体孕期咖啡因暴露具有胎儿发育毒性，可引起子代iugr、低出生体重，子代睾丸发育不良的风险增加。近期，随着父源性因素在子代发育中的角色被关注，本发明将目光聚焦于父体孕前咖啡因暴露(paternal pro-gestational caffeine exposure,ppce)大鼠模型上，证实了ppce可致子代睾丸发育不良，由此提供一种父源性睾丸发育不良动物模型的构建方法及其应用。

4、主要参考文献：

5、1.suzuki k:the developing world of dohad.j dev orig health dis 2018,9(3):266-269.

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10、6.mcpherson no,fullston t,aitken rj,lane m:paternal obesity,interventions,and mechanistic pathways to impaired health in offspring.annnutr metab 2014,64(3-4):231-238.

11、7.grosso g,godos j,galvano f,giovannucci el:coffee,caffeine,andhealth outcomes:an umbrella review.annu rev nutr 2017,37:131-156.

12、8.jia h,liu w,liu j,jin q,li c,yu y,meng l,wu g,zhao r,zhao y:[assessment of caffeine intake in children and adolescents aged 6-17years inbeijing city].wei sheng yan jiu 2020,49(2):220-226.

13、9.drewnowski a,rehm cd:sources of caffeine in diets of us childrenand adults:trends by beverage type and purchase location.nutrients 2016,8(3):154.

14、10.fulgoni vl,3rd,keast dr,lieberman hr:trends in intake and sourcesof caffeine in the diets of us adults:2001-2010.am j clin nutr 2015,101(5):1081-1087.

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种成功率高、有效可靠、可重复性强、简便易行的父源性睾丸发育不良的动物模型构建方法。

2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供一种父源性睾丸发育不良动物模型的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：

4、s1：选取健康8周龄雄性wistar大鼠，在8～16周龄的时间段内，每日给予15、30和60mg/kg咖啡因胃內灌注，且自由饮食；

5、s2：给药完成后，与12周龄的正常雌性wistar大鼠进行合笼受孕，所获取的孕鼠自然生产，获得f1代，以生产日作为出生后0天，出生后1天时选取窝仔数为12～14只的窝仔，调整每窝雄、雌性仔鼠各6只进行哺乳喂养；

6、s3：仔鼠出生后4周断奶并雄、雌分笼，部分继续正常饮食饲养至6、12和32周；分别于各个时间点进行睾丸功能相关指标检测来判断睾丸发育不良发生；最终得到父源性睾丸发育不良动物模型。

7、s4：部分子代饲养至出生后6周，再给予睾丸曲细精管局部显微注射腺相关重组病毒过表达mest，两周后检测睾丸功能相关指标，以判断睾丸发育不良是否被改善。

8、进一步地，所述步骤s1中，正常饮食是配方与《中华人民共和国国家标准gb14924.3-2001》规定的小鼠、大鼠配方饲料相同。

9、更进一步地，所述步骤s3、s4中，睾丸功能相关指标是：睾丸形态、血睾酮水平、睾丸内生睾酮水平、睾丸睾酮合成酶(star、p450scc、3β-hsd)系统表达、精子质量(精子数、活力、形态等)、交配成功率。

10、第二方面，本发明提供一种父源性睾丸发育不良动物模型在筛选亲代环境、内分泌干扰物或药物等中的应用，其特征在于：所述父源性睾丸发育不良动物模型由如以上任一构建方法得到。

11、第三方面，本发明提供一种父源性睾丸发育不良动物模型在筛选睾丸发育不良早期预警及干预靶标中的应用，其特征在于：所述父源性睾丸发育不良动物模型由如以上任一构建方法得到。

12、第四方面，本发明提供一种父源性睾丸发育不良动物模型在筛选防治睾丸发育不良治疗的应用，其特征在于：所述父源性睾丸发育不良动物模型由如以上任一构建方法得到。

13、本发明的技术原理及研究过程如下：

14、本发明通过模拟男性日常生活中咖啡因的易获取等特点，构建了ppce动物模型，动过获取出生前后不同时间点雄性子代，检测睾丸功能相关指标确定睾丸发育不良的发生发展，进而建立父源性睾丸发育不良大鼠模型。该模型模拟了父源性睾丸发育不良发生发展的疾病表型，对阐明父源性睾丸发育不良的发生发展机制，确定早期预警及防治具有重要意义。

15、本发明的优点及有益效果如下：

16、1、造模方法简单易行、可重复性高：本发明的造模方法简单，父体孕前给予咖啡因，并与正常雌性交配获取出生前后不同时间点雄性子代，检测睾丸形态、血睾酮水平、睾丸睾酮合成酶系统(包括star、p450scc、3β-hsd)表达、睾丸内生睾酮水平、精子质量(精子数、活力、形态等)以及交配成功率来观察睾丸功能改变情况，并判断睾丸发育不良是否发生。本模型指标稳定性好，可重复性高，为父源性睾丸发育不良提供了一种可靠的方法。

17、2、该模型应用广泛、研究意义大：基于本发明构建的父源性睾丸发育不良模型，可用于指导男性健康饮食生活、有利于探讨父源性睾丸发育不良的发生发展机制、早期预警及干预靶标中的应用。