一种胎生睡莲的快速繁殖方法与流程

本发明属于睡莲植物组织培养，具体涉及一种胎生睡莲的快速繁殖方法。

背景技术：

1、睡莲是睡莲科(nymphaeaceae)睡莲属(nymphaea)的多年生草本花卉，睡莲科植物在系统进化上具有极高的研究价值。睡莲植物类群众多，分布广泛，花色丰富，花叶俱美，在园林水景中扮演重要角色。同时，睡莲属植物富含黄酮、生物碱等多种活性成分，具有抗菌消炎、降血糖和降血压等多种功效；睡莲的根能吸附水中重金属，净化水体；睡莲的花香成分可以用来制作香水，在美容行业中也发挥了一定的作用。此外，睡莲在文学、艺术、宗教等社会科学领域都具有重要地位。

2、睡莲的繁殖方式多样，兼具有性繁殖和无性繁殖。传统的睡莲繁育通常采用种子、块茎或球茎组织进行繁殖，然而，大多数睡莲结实率低，种子小且实生苗在早期长势较弱，容易遭藻类或蚊虫破坏。长期采用块茎和球茎进行的无性繁殖容易造成病原菌的积累，导致睡莲资源的品质下降、品种退化，同时无性繁殖也受气候条件影响大，尤其是热带睡莲在秋冬季节种质资源严重缺乏，无性繁殖效率低，难以满足市场需求。

3、叶片胎生作为一种特殊的无性繁殖方式，在部分睡莲种的叶片叶脐部位产生胎生芽进而分化形成独立植株，胎生苗由母体叶片提供营养。然而，胎生芽分化形成完整的独立植株前，母叶大多已经开始发黄腐烂，胎生苗的生长受温度光照等多种因素影响，尤其在秋冬季节仍有多数胎生芽发育受阻，最终并未能产生真正胎生苗。此外，胎生苗必须尽早接触土壤生根保证营养供给，然而受水中浮力作用，脱离母体的胎生苗经常漂浮在水面，营养供给不充分，长势弱，最终腐烂。尤其到了冬季，受气候条件影响，即便是长在温室的胎生睡莲，其叶片胎生芽也基本处于发育停滞状态。

4、中国专利201810858776.5公开了“一种睡莲胎生块茎诱导无菌芽的培养基及其培养方法”，该专利中以‘蓝鸟’睡莲块茎为材料进行无菌芽诱导的方法，此方法以块茎作为外植体培养，睡莲块茎作为外植体数量极其有限，导致繁殖系数偏低。

5、中国专利201710212711.9公开了“一种利用睡莲组织快速育种的方法”，该方法在睡莲叶茎交汇处用植物生长精激活因子激活处理，从而提高睡莲的繁殖系数。

6、中国专利202210146030.8公开了“一种热带睡莲叶脐胎生体的快速繁育方法”，热带睡莲‘鲁比’和‘黑美人’胎生体通过施肥移栽实现快速育苗的方法，这两个方法都是直接利用池塘里睡莲母株作为研究材料，通过喷施激素或者施肥管理来进行繁殖育苗，缺点是母株繁殖系数低，对环境温度要求高，培养周期长，仅适合热带和亚热带地区生长，没有考虑睡莲的生态差异，尤其是热带睡莲在温带地区越冬繁殖问题存在巨大限制，胎生芽产量低且发育受阻，以上专利均未提及这一现实问题。

7、目前有关睡莲叶片胎生特性方面的研究较少，胎生苗的生长发育受季节影响极大，水域环境和生长空间也影响母体植株长势，导致叶片胎生的繁殖系数和发育周期不稳定，难以满足市场和科研需要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种胎生睡莲的快速繁殖方法，通过组织培养的方式实现胎生睡莲的快速繁殖，操作简便、周期短、繁殖系数高，能有效解决热带睡莲在秋冬季节胎生发育缓慢、资源缺乏等问题，减少了气候环境对睡莲发育的影响，提高了胎生睡莲的繁殖率。

2、为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种胎生睡莲的快速繁殖方法，包括以下步骤：

4、1)外植体取材和消毒

5、将睡莲叶脐部位带有直径为1～3mm的胎生芽连同叶柄切下来作为外植体，用清水冲洗，并在体视显微镜下将外植体表面棉毛去除，用刀片切除周围多余组织，经清洗和消毒后备用；

6、2)胎生芽诱导

7、在无菌条件下，将消毒后的外植体接种于诱导培养基中培养，直至外植体分化产生3～5片叶原基；

8、其中，所述诱导培养基为固液双层培养基，上层为液体培养基，下层为固体培养基；

9、所述上层液体培养基以ms培养基为基础培养基，添加1.0～3.0mg/ltdz，0.1～1.0mg/liaa，20～30g/l蔗糖；

10、所述下层固体培养基以ms培养基为基础培养基，添加1.0～3.0mg/ltdz，0.1～1.0mg/liaa，20～30g/l蔗糖，5～10g/l琼脂；

11、3)增殖培养与分化

12、取步骤2)获得的组织接种于增殖培养基中，培养15～20天，该组织呈簇状胎生苗，分化的叶片数量多于10片，且部分新生叶片叶脐部位能诱导产生新的胎生芽。

13、其中，所述增殖培养基为固体培养基，以ms培养基为基础培养基，添加1～3mg/ltdz，0.1～1.0mg/liaa，20～30g/l蔗糖，5～10g/l琼脂；

14、4)生根与移栽

15、将步骤3)获得的簇状胎生苗直接移栽到泥土中，加水并使其完全浸没在水中，培养10～15天后基部产生若干细长白根。

16、优选的，所述增殖培养基ph为5.7～5.8。

17、进一步，步骤1)中，切除外植体周围多余组织后的清洗消毒步骤为：先用自来水冲洗至少30min，接着将其转入70～75％乙醇中浸泡处理45～60s后，再用无菌水清洗3～5min，随后用15～20％次氯酸钠溶液浸泡处理10～15min，浸泡过程中晃动不少于三次，最后用无菌水清洗三至五次，每次3～5min。

18、优选的，步骤2)和步骤3)中，培养条件为：温度25±2℃，光照时间为每天16～18h，光照强度为60～80μmol·m-2·s-1。

19、如无特殊说明，本发明所述的单位mg/l或g/l是指在1升培养基中各组分的含量。

20、本发明以睡莲叶脐部位带有1～3mm的胎生芽切下来作为外植体，我们前期观察到，胎生芽既具有极强的分化潜力，能持续发育产生新的植物组织和器官，它又保留了物种的遗传特性，是研究睡莲胎生特性的关键组织。同时，在提高繁育系数方面，胎生芽相较于基部根茎组织而言，数量众多，具有取材方便快捷的优点，对植物的伤害也最小。

21、外植体清洗过后，需要在体视显微镜下用镊子将外植体表面的棉毛去除。附着在胎生芽上的毛状结构对于早期胎生芽的发育具有保护作用，同时毛状物具有一定锁水功能，使胎生芽处于湿润环境，这对于水生植物而言十分重要。然而棉毛结构容易粘附众多杂质和菌类物质，容易导致外植体的污染，大量棉毛附着在胎生芽表面也影响了对芽组织发育过程的观察，因此，要尽可能去掉棉毛。外植体上少量小棉毛的存在影响不大，消毒彻底并不会导致后续的污染。

22、本发明在胎生芽诱导过程中采用固液双层培养基进行培养，能较快地诱导外植体产生叶原基，减轻外植体的褐化程度，并且产生的叶原基数量多，叶柄短而壮。

23、此外，本发明在增殖培养后，将获得的带有多个叶片的簇状胎生苗直接移栽在泥土中，十天后，发现其开始产生大量白色细根。而不是像传统的快繁方法一样在生根培养基中培养至生根后再移栽到泥土中。

24、需要注意的是，将增殖培养后的呈现多个叶片的簇状胎生苗移栽入泥土中，需要加入足够多的水，保证加入的水全部没过植株，因为植株一旦因缺水暴露在空气中便会干枯，难以成活。

25、与现有技术相比，本发明具有的有益效果：

26、1)采用本发明方法进行胎生睡莲的快速繁殖，操作简便，从开始培养到移入土壤中生根成为完整独立植株仅需一个月的时间，所需时间较常规睡莲繁殖时间大大缩短，在短期内获得大量与母体遗传性状一致的睡莲幼苗，对于种质资源的保存、生产和创新具有重要意义。

27、2)采用本发明方法每个胎生芽经过一个月培养后，能发育形成根、茎、叶等组织完整的幼苗，且新生叶片叶脐处保留了胎生特性，这极大地提升了胎生芽的繁殖系数，缩短了胎生苗的发育周期，打破了气候和地域条件对睡莲胎生长发育的限制，对于种质资源利用提供了保障，有利于繁育名优睡莲品种，同时规模化生产能满足国内外市场需求。

28、3)本发明提出在早期外植体胎生芽诱导阶段使用固液双层培养基，而在增殖阶段选择固体培养基，且增殖培养后无需更换生根培养基，直接进行移栽，该技术操作简便，不需另外配制生根培养基，大大降低了配制培养基的药品、试剂的成本。