一种花楸树四倍体的诱导方法及其应用

本发明属于生物领域，具体涉及一种花楸树四倍体的诱导方法及其应用。

背景技术：

1、花楸属植物(sorbusl.)隶属蔷薇科(rosaceae)苹果亚科(maloideae)，多为落叶乔木或灌木，自然分布在北半球的亚洲、欧洲和北美洲等地区，全球约258种(phipps j b,1988.a checklist of the subfamily maloideae(rosaceae)[eb/ol].(1988-08-22)[2022-09-08])，花楸属中杂交、多倍体和无融合生殖现象较为常见，造就了属内较多倍性形式共存的状态，nelson-jones(nelson-jones e,briggs d,smith a,2002.the originof intermediate species of the genus sorbus[j/ol].theoretical and appliedgenetics,105(6):953-963.)发现欧洲的花楸属中存在2×、3×、4×三种倍性；pellier(pellicer j,clermont s,houston l,et al.,2012.cytotype diversity in the sorbuscomplex(rosaceae)in britain:sorting out the puzzle[j/ol].annals of botany,110(6):1185-1193)则在花楸样本倍性研究中证明，花楸属存在2×、3×、4×和5×四种细胞类型，并且部分种群中存在几种倍性共存的情况；在中国本土花楸属植物研究中，郗连连(郗连连等,2020)依据基因组大小证明了川滇花楸(s.vilmorini)为四倍体植物；li(li j,zhuk,wang q,et al.,2021.genome size variation and karyotype diversity in eighttaxa of sorbus sensustricto(rosaceae)from china[j/ol].comparativecytogenetics,15(2):137-148)则在8个天然分类群中发现了s.filipes、s.ovalis两种分布在中国的四倍体花楸属植物。目前花楸属内多倍性研究主要集中在花楸属植物分类中，而未见有关多倍体育种相关报道。

2、花楸树(s.pohuashanensis(hance)hedl.)，为花楸属已知的二倍体树种，主要分布在中国西北、华北及东北地区，分布范围横跨暖温带、温带2个气候带(郑健,2008.花楸树遗传资源评价、保存与利用[d/ol].中国林业科学研究院[2022-09-10])。花楸树自然资源集中分布在海拔1200-2000m间，因其多彩的秋色叶片和果实而具有极高的观赏价值，受到了城镇园林绿化的青睐；加之其果实富含黄酮类化合物，有利于心脏保护作用，因而有着很高药用前景。但是，花楸树在低海拔驯化中受到夏季高温、干旱及弱碱性土壤等非生物胁迫的制约，植株越夏时并伴有叶片“日灼”(sunburn)现象发生(zhao d,qi x,zhang y,etal.,2022.genome-wide analysis of the heat shock transcription factor genefamily in sorbus pohuashanensis(hance)hedl identifies potential candidatesfor resistance to abiotic stresses[j/ol].plant physiology and biochemistry,175:68-80)，影响自身观赏价值；此外花楸树种内天然变异幅度有限，同时育种改良工作较少且手段单一(谷艳鹏,张泽人,孙涛,等,2022.基于est-ssr标记的花楸树和少叶花楸杂交f_1代群体的杂种鉴定及遗传关系分析[j].植物资源与环境学报,31(4):65-73)，需要通过其他育种手段增加种内变异，增强花楸树抗性的同时提高观赏价值，并为新品种选育提供广泛的变异基础。

3、多倍体是拥有两套以上完整染色体的细胞或生物体，通常由有丝分裂或减数分裂错误而引起的染色体组整倍变化，其广泛发生在被子植物当中。多倍化或全基因组复制事件(wgd)是植物进化的重要动力。染色体加倍后，常表现出远超未加倍个体的性状变异，如多倍体植物中更快地生长速度；更大的器官；结实率增加产量提高；植株抗性的加强等。林木改良一直是林木遗传研究的重要工作，多倍体的诱导有助于新物种的产生，推动植物多样性发展，故以倍性育种作为种质创新手段的例子并不少见，如用材树种中，异源三倍体杨树品种拥有更快的生长速度和更高的生长量；经济树种中，多倍化带来了更高的果实产量增加果实中总糖、可溶性固形物等物质含量；还可利用倍性育种选育适应性强、生长快、生物量大的优秀多用途树种。另外多项研究证明了三倍体林木拥有着远超二倍体的生长优势与优良性状，着手诱导与培育四倍体植株不仅创新了种质，同时也为三倍体品种创制提供了可能。

4、从1937年blakesle利用秋水仙素诱导曼陀罗四倍体成功后，学者们开始了人工诱导多倍体的探索。人工诱导多倍体的方法根据处理手段可分为物理诱导手段(例如机械损伤、极端温度、射线等)与化学诱导(如秋水仙碱、黄草硝、氟乐灵、萘嵌戊烷等)，例如杨树中采取物理手段通过极端高温或低温的方式诱导植株成功加倍梨试管苗利用γ射线照射，经继代培养后同样可得到多倍体植株。目前大多数多倍体诱导都是通过化学试剂处理植物(离体)器官(种子、顶芽、幼苗或外植体)来获得，因此有关于不同处理试剂、化学试剂浓度、多倍体诱导效果的影响因素等探索是多倍体研究的重点之一。许多林木品种已通过人工诱导获得多倍体植株，并探寻影响诱导的因素与最优诱导方法，与之成对比的是，花楸树中关于多倍体诱导方法的研究尚未见报道，倍性育种仍处于空白阶段。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种采用秋水仙素对花楸树种子进行诱变的方法，人工诱导培育花楸树四倍体，为花楸树人工同源多倍体研究奠定基础，也为花楸树抗逆、优质新品种选育提供新种质资源。

2、本发明的具体技术方案如下：

3、一种花楸树四倍体的诱导方法，包括下述步骤：

4、1)将花楸树种子在0-5℃(具体可以为4℃)低温层积14-28天；

5、2)将步骤1)低温层积后的花楸树种子在质量百分浓度为0.2％的秋水仙素溶液中浸泡诱导48小时；然后，继续在0-5℃低温层积，使总低温层积天数达到28天；

6、3)将步骤2)处理过的种子播种，幼苗期，筛选花楸树四倍体幼苗。

7、在本发明的一个实施方式中，花楸树种子在低温层积之前用1g/l赤霉素(ga3)溶液处理24小时。

8、在本发明的又一个实施方式中，筛选花楸树四倍体幼苗的方法是采用流式细胞仪对幼苗进行染色体倍性分析。

9、所述的方法在获得气孔长、宽和气孔中叶绿体数量显著提高的花楸树植株中的应用也属于本发明的保护范围。

10、所述的方法在获得株高降低、植株地径增大的花楸树植株中的应用也属于本发明的保护范围。

11、所述的方法在获得顶端、中部小叶宽增大的花楸树植株中的应用也属于本发明的保护范围。

12、本发明具有以下有益效果：

13、我们利用秋水仙素处理花楸树种子成功诱导出了花楸树同源四倍体，且发现秋水仙素溶液浓度是影响多倍体花楸树成功诱导的关键因素，且0.2％浓度下秋水仙素诱导48h效果更好，四倍体诱导率可达24.75％，种子来源与对多倍体花楸树诱导无影响。通过连续两年的形态学观测、相关性与主成分分析，四倍体花楸树气孔长、宽和气孔中叶绿体数量显著提高，株高降低、植株地径增大，顶端、中部小叶宽增大。