一种利用雌激素相关受体调控家蚕表皮黑色素形成的方法与流程

本发明属于生物，涉及一种利用雌激素相关受体调控家蚕表皮黑色素形成的方法。

背景技术：

1、昆虫体色和斑纹的多样性有利于昆虫躲避敌害、体温调节、寻求伴侣、适应地理和抵抗紫外线等，是生物进化和自然选择的结果，具有重要的生物学意义。家蚕是鳞翅目昆虫的模式昆虫，具有较高的经济价值。家蚕品种众多，不同品种间家蚕体表的斑纹也不尽相同。有研究人员利用杂交选育等遗传操作培育出了斑纹限性品种家蚕(姚陆松,杜鑫,陈金娥等.斑纹全限性四元杂交多丝量家蚕新品种农科2号的选育[j].蚕业科学,2019,45(04):594-597.doi:10.13441/j.cnki.cykx.2019.04.018.；龚大刚,鲜跃荣,冯光强.春秋兼用四元杂交斑纹全限性家蚕新品种锦·苑×绫·州的选育[j].蚕业科学,2017,43(06):1039-1044.doi:10.13441/j.cnki.cykx.2017.06.021.；张友洪,肖金树,肖文福等.春秋兼用斑纹双限性家蚕品种蜀63×限16的育成[j].蚕业科学,2015,41(06):1017-1022.doi:10.13441/j.cnki.cykx.2015.06.007.)；斑纹限性品种家蚕在幼虫期可以依靠其体表斑纹的不同区分雌雄，实现雌雄蚕分养或专养雄蚕，从而具有降低蚕种生产成本、提高蚕种品质、增加蚕种繁育系数以及拓宽茧丝的应用范围等优势。

2、传统杂交育种是将斑纹限性品种与正常品种多次杂交，从而将限性斑纹的性状转移至正常品种中，从而获得新的斑纹限性品种。其也存在明显的不足：(1)周期长；选育一个新的斑纹品种需要两年左右的时间，耗费较高的人力物力；(2)具有品种限制性。目前全国各个蚕区具有不同的主流品种，例如“两广2号”在两广(广西、广东)蚕区覆盖面较广、推广数量最多；西南蚕区则主推“川山×蜀水”家蚕品种。杂交选育难以在这些主流品种上进行遗传改良。

3、家蚕斑纹的形成主要由基因控制。黑色素代谢通路是影响家蚕体表斑纹生成的主要信号通路。例如，yellow-y基因和酪氨酸羟化酶(tyrosine,th)基因是控制ch突变体幼虫体色呈现巧克力色的主要原因；家蚕暗化型突变体(mln)体内由于aa-nat1基因出现了碱基缺失从而呈现黑化。这表明通过改变家蚕体内基因的表达来控制表皮斑纹的形成是具有一定的理论基础。

4、雌激素相关受体(estrogen-related receptor，err)，是重要的核受体，其在昆虫的能量代谢和生长发育过程中发挥了重要的调控作用。无论是哺乳动物还是无脊椎动物中，此前从未报道过增加家蚕体内bmerr的表达，会导致表皮斑纹增加。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明一方面通过基于转基因技术的遗传改造手段来改变家蚕体内bmerr基因的表达，进而影响表皮斑纹的形成，其效率更高，周期更短(一般半年时间就可以获得斑纹稳定遗传的性状)；另一方面，本发明适应性较高，可以通过调控任意家蚕品种体内bmerr基因的表达量来改变表皮斑纹，无品种限制。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了家蚕bmerr基因在调控家蚕表皮黑色素形成中的应用。本发明通过调控家蚕体内bmerr基因的表达量来改变家蚕表皮黑色斑纹。家蚕bmerr基因cds如seq idno:1所示。

4、本发明还提供了一种利用家蚕bmerr基因调控家蚕表皮黑色素形成的方法，包括以下步骤：

5、1、家蚕bmerr基因的克隆：

6、以五龄第三天家蚕品种dazao脂肪体的cdna为模板进行pcr扩增，设计引物，上游引物为：5’-atgatgtccgcagtcagtgg-3’，下游引物为：5’-ttaccgcagacaggcctc ga-3’，扩增条件为95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟，4℃保存，获得seq id no:1所示序列(bmerr cds序列)。

7、2、构建含家蚕bmerr基因的重组载体

8、a、家蚕bmerr基因cds的ta克隆

9、将如seq id no:1所示序列的家蚕bmerr基因cds与载体pmd-19t simple进行ta克隆，得到重组载体pmd-19t simple-bmerr；

10、b、含有增强子-全身性表达启动子-家蚕bmerr基因cds的重组载体的构建

11、设计同源重组引物，上游引物为：5’-aggattggtggatccatgatgtccgcagtcagtg g-3’,下游引物为：5’-agttgtagcggccgcttaccgcagacaggcctcga-3’，利用pmd-19t simple-bmerr为模板进行扩增，扩增条件与“家蚕bmerr基因克隆”中的扩增条件一致，回收扩增得到的bmerr基因cds片段。用not i和bamh i双酶切psl1180[hr3-a4-dsred-sv40]质粒，回收psl1180[hr3-a4-sv40]载体片段，将回收得到的bmerr基因cds与psl1180[hr3-a4-sv40]载体片段利用同源重组的方法进行连接，构成psl1180[hr3-a4-bmerr-sv40]重组质粒；

12、c、显微注射载体的制备

13、设计同源重组引物，上游引物为：5’-ttatcgatacgcgtacggcgcagcgtcgtgaaaagaggcaatgac-3’，下游引物为：5’-gagatcggccggcctaggcgttcgtcaatgtatcag ttttggtgc-3’，以psl1180[hr3-a4-bmerr-sv40]重组质粒为模板进行pcr扩增，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸210秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟，从而获得hr3-a4-bmerr-sv40片段。用限制性内切酶asci酶切pbac[3×p3-red-sv40]基础载体，将回收的hr3-a4-bmerr-sv40片段连接到酶切后的pbac[3×p3-red-sv40]基础载体，构建pbac[3×p3-red-sv40,hr3-a4-bmerr-sv40]显微注射载体；

14、3、在家蚕中过表达bmerr基因促进家蚕表皮斑纹形成

15、将pbac[3×p3-rsred-sv40,hr3-a4-bmerr-sv40]质粒与辅助helper质粒按1:1摩尔比混合后显微注射家蚕蚕卵。

16、待蚁蚕孵化后，常规桑叶饲养g0代家蚕。化蛾后进行同圈交配，得到g1代个体；常规催青g1代蚕卵。催青6天后，筛选眼部发射红色荧光的蚕卵，即为阳性g1代转基因过表达bmerr家蚕个体；蚕卵出蚁后，桑叶饲养单蛾圈阳性g1代转基因家蚕个体。化蛾后进一步通过荧光筛选确认，并进行单蛾圈内交配，获得g2代阳性转基因过表达bmerr家蚕个体。

17、本发明的有益效果在于：

18、本发明公开了家蚕bmerr基因影响家蚕表皮斑纹形成的功能，是一个控制家蚕表皮斑纹形成的基因靶标。

19、本发明适应性较高，可以通过调控任意家蚕品种体内bmerr基因的表达量来改变表皮斑纹，无品种限制。

20、本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。