一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法

本发明涉及植物科学领域，涉及了一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法；具体的是，涉及了一种降低盐胁迫下海滨雀稗叶片茉莉酸含量且延缓叶片衰老的方法。

背景技术：

1、当植物遭受到环境胁迫时会产生并积累活性氧(ros)；高浓度的ros对植物细胞具有毒害作用，但低浓度的ros则作为信号物质调节植物对非生物胁迫的响应；已有的研究表明，质膜nadph氧化酶是一类跨膜氧化还原酶，在应答非生物胁迫反应和调节植物的生长发育中发挥着非常重要的作用；近年来的研究强调，质膜nadph氧化酶介导的h2o2在植物感应和响应盐胁迫中起着关键地正向调控作用；不同于甜土植物，盐生植物通过长期地进化已经建立了强大而精密的的耐盐机制；有研究证明，盐生植物海滨雀稗根系会通过主动吸收na+的方式促进根源h2o2的产生，从而激活抗氧化系统和脂膜适应性重塑等关键耐盐策略，以提高海滨雀稗的耐盐性；此外，最新研究表明，根源nadph氧化酶介导的h2o2还参与调控植物衰老激素脱落酸(aba)诱导的叶片衰老；

2、茉莉酸(ja)由环境因素控制的植物衰老激素且对叶片衰老起正向调控作用；盐胁迫会诱导根系中内源ja的产生和积累，导致叶片中ja含量上升，叶绿体降解，促使叶片衰老的发生；但是，目前盐驱动下根源h2o2是否参与调控ja内源稳态平衡以延缓叶片衰老的发生，尚未见报道。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明为了解决现有技术中的问题，而提出了一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法；其目的是在于证明海滨雀稗根源h2o2通过影响茉莉酸合成从而延缓盐胁迫下的叶片衰老。

2、本发明的技术方案是：本发明所述的一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法，其具体的操作步骤如下：

3、步骤(1)、植物材料培养和盐胁迫处理；具体是；

4、选取两个月大小和生长一致的海雀稗材料匍匐茎种植于底部有孔的育苗杯中；在ph＝6.0的霍格兰溶液中水培，每7天更换一次溶液；

5、将海雀稗材料匍匐茎生长到第14天，放入植物培养箱进行盐处理；

6、其中，所述植物培养箱光照周期为16h/8h(光照/黑暗)，温度为30℃/28℃(白天/夜间)，相对湿度为70％，光强为1000lx；

7、后将盐处理的海雀稗材料和对照处理的海雀稗材料分别在添加或不添加400mmnacl的水培塑料容器中进行；nacl浓度每天逐渐增加100mm，直到达到目标浓度400mm；在盐处理的第五天，分别从盐处理和对照处理的海雀稗材料中取样；为了研究nadph氧化酶介导根源h2o2的实验，在400mm nacl溶液中添加100μm二苯基氯化碘(dpi)；

8、处理5d后，收集根系用于后续分析。每个处理设置6个生物学重复；使用3至6个生物重复进行如下实验；

9、步骤(2)、h2o2含量测定；具体是：采用h2o2测定试剂盒含量测定根源h2o2含量的变化；

10、步骤(3)、dab染色；具体是：将分离的根系放入浓度为0.5mg/ml的dab染液中，在室温(通常是25-30℃)下避光中染色2h至6h；最后用纯水冲洗5次后，拍照并室温保存；

11、步骤(4)、叶绿素含量和fv/fm值测定；具体是：总叶绿素含量(chl(a+b))测定采用分光光度法；

12、用蒸馏水冲洗干净叶片后用滤纸吸干表面水分，快速称取剪碎的鲜叶片3份，每份2g，放入加有少量石英砂的研钵中充分研磨成浆，再加入乙醇10ml，继续研磨至组织变白；

13、在漏斗中过滤后，用乙醇将滤液定容100ml；

14、分别在665nm、645nm和652nm下测定吸光度，以95％乙醇为空白对照；chl(a+b)＝a625/35.5×v÷1000×w；

15、步骤(5)、脂质组学数据测定和分析；具体是：取约100mg叶片和根系样本，加入液氮并研磨成粉末，用甲醇：蒸馏水(1：1)提取脂质。使用nexera uhplc lc-30a系统(shimadzu,kyoto,japan)和tripletof5600+(ab sciextm)质谱仪进行脂质的lc-ms分析。柱温设置为40℃；

16、流动相为0.1％hcooh-h2o(a)-乙腈(b)，流速为0.3ml/min，梯度洗；

17、所述tripletof5600+(ab sciextm)质谱仪中esi源条件设置如下：离子源gas1(gas1)：50，离子源gas2(gas 2)：50，幕气(cur)：25，源温度：500℃/450℃(正离子/负离子)，离子萨帕里电压浮动(isvf)5500v/4400v(正离子/负离子)，tof-ms扫描范围：100-1200da,tof ms扫描积累时间0.2s，脱簇电位(dp)：±60v；

18、lipidsearch软件用于脂质自动鉴定和相对定量分析(thermo fisherscientific,ca,usa)；

19、步骤(6)、内源激素水平分析；具体是：将50mg新鲜根系冷冻在液氮中并放入2ml的塑料微管中进行样品的制备和提取；

20、采用基于ab sciex qtrap 6500 lc/ms/ms系统进行植物激素含量的检测；

21、步骤(7)、实时定量pcr技术分析基因表达水平；具体是：利用实时定量pcr分析四个基因的相对表达量；根据基因序列设计特异性引物进行合成；

22、取2.5μl总rna按照bio-rad iscript cdna synthesis kit说明书逆转录成cdna；pcr通过abi7500 real-time pcr system(applied biosystems)和premix ex-taqtmii得以运行；pcr扩增采用20μl体积，每个pcr反应管内加入cdna工作液2.5μl，pcr-mix 10μl,5.5μl高压灭菌去离子水、上下游引物各1μl；

23、pcr的反应条件设置为：95℃预变性30s，1个循环；95℃变性5s；60℃退火34s；72℃延伸45s，40个循环；

24、设置在延伸阶段收集荧光信号，反应结束后导出ct值；

25、按照公式2-δδct计算相对表达量；

26、α-actin基因作为内参基因，对处理和对照材料进行相对定量分析，每个样品设置3次重复；

27、步骤(8)、转录组学数据及分析；具体是：利用植物总rna试剂盒提取叶片和根系的总rna；

28、转录组测序和从头组装cdna文库的配对末端测序是使用hiseq 2000(illuminatechnologies)平台进行；

29、对原始读数进行质量评估，然后使用trimmomatic(v0.32)过滤接头序列和低质量碱基。clean reads使用hisat2(v2.1.0)与参考基因组对齐；通过计算每千碱基每百万映射读数(rpkm)的读数来标准化基因表达；

30、使用r软件的deseq2包确定差异表达基因，并以错误发现率(fdr)≤0.05和|log2fc|≥1作为阈值来确定基因表达的统计学显着差异；

31、进行了go分析和kegg代谢通路分析，以确定差异表达基因的生物学作用和功能；

32、rna-seq读数存放在ncbi序列读取档案(sra)(bioproject登录号：prjna874860)。

33、本发明的有益效果是：1、利用nadph氧化酶抑制剂特异性抑制剂二苯硫碘(dpi)研究根源h2o2的作用是实施本项目的第一个关键技术；dpi作为常见且重要的一种根源nadph氧化酶抑制剂，100μm的该酶可以完全抑制该酶介导的根源h2o2，便于研究根源h2o2含量较低对叶片衰老的影响；2、从基因表达层面，探究根源h2o2存在与否对茉莉酸合成前体物质相关基因表达的影响；3、基于质谱技术的组学技术及数据分析是实施本项目的第一个关键技术；脂质组学，作为最重要的代谢组学分支之一，可在单个脂质种类水平进行定性和定量。