一种掌叶覆盆子组织培养优质种苗繁殖方法

：本发明属于植物生物，具体涉及一种掌叶覆盆子组织培养优质种苗繁殖方法。

背景技术

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背景技术：

1、掌叶覆盆子(rubus chingii hu)，为蔷薇科(rosaceae)悬钩子属(rubus)“药果同源”植物，以未成熟的干燥果实入药，是目前194种悬钩子属植物中唯一入选《中华人民共和国药典》的覆盆子，具有益肾固精缩尿、养肝明目的功效(yu g,luo z,wang w,li y,zhouy,shi y.rubus chingii hu:areview ofthe phytochemistry andpharmacology.frontpharmacol.2019,10:799)。掌叶覆盆子成熟果实是高端功能性水果，富含鞣花酸、花青素、有机酸、氨基酸及多种维生素、矿质元素，特别是过氧化物歧化酶(superoxide dismutase,sod)含量为水果之最，是具有抗氧化、抗衰老、保健、美容之功效的“黄金水果”、“新型第三代水果”。因此，开发和利用掌叶覆盆子具有极大的发展潜力和蓬勃发展的市场前景。

2、我国掌叶覆盆子野生资源丰富，生于林地山坡或溪涧山谷，人工种植通常采用根蘖、压条、扦插和分株等繁殖措施，但良种来源短缺，种子萌发困难，扦插不易生根，繁育效率低，品种易混杂，长时间下来，易造成病毒繁殖，产量匮缺，品质骤降(王云冰,江景勇.掌叶覆盆子诱导培养的抗褐化研究.浙江农业科学,2020,61(1):46-48)。因此，采用组织培养繁育措施不但可以确保种质纯正，而且可以迅捷供应规格一致的脱毒种苗，进而满足种苗市场需求。

3、外植体来源及年龄是决定植物组培成功的重要因素。近年来已有部分掌叶覆盆子组培体系的建立，但主要都集中在茎段，包括带腋芽的茎段(汤访评,窦晓宁,方晶晶,王倩.掌叶覆盆子脱毒种苗的离体快繁方法.中国,zl105918126a,2016-09-07)、当年生茎段(王利平,陈珍,江景勇,郑江仙,徐婷婷,宋颖婷.优质掌叶覆盆子快繁体系的建立.浙江农业科学,2013,8:967-970)、一年生带芽枝条(谢从寿,陈泳和,应薛养,郑平汉,杨福良,饶宝蓉,熊欣沁,胡建珠,陈琦辉.掌叶覆盆子组培快繁技术.福建农业科技，2020,10:32-36)、当年生幼嫩枝条(汪秀媛,邹奕巧,刘玲玲,陈珍,江景勇.掌叶覆盆子组培快繁体系中生长调节剂与矿质元素的优化.浙江农业学报,2022,34(7):1431-1438)和根蘖芽段、带芽枝段及当年生茎段(王云冰,江景勇.掌叶覆盆子诱导培养的抗褐化研究.浙江农业科学,2020,61(1):46-48,51)，然而目前尚无采用叶片作为外植体建立掌叶覆盆子组织体系的相关研究。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的目的在于：提供一种掌叶覆盆子组织培养优质种苗繁殖方法。本发明的掌叶覆盆子优质种苗获得，涵盖以下步骤：

2、(1)无菌外植体的获取及消毒措施：以毛刺少、山奈酚-3-o-芸香糖苷含量高的掌叶覆盆子植株上正常生长、无病害的第3-7片新生叶作为外植体，采用75％乙醇溶液擦拭叶表面2-4次，随即转移到超净工作台上，采用75％乙醇溶液消毒20-40s，无菌水洗涤3-5次，再采用0.1％升汞溶液消毒6-8min，无菌水洗涤3-5次，采用滤纸片吸干水分备用。

3、(2)愈伤组织的诱导：利用无菌解剖刀将消毒好的掌叶覆盆子叶片裁减成0.8-1.2cm2方块大小，置于诱导培养基上，所述的诱导培养基每升含2-4mg 6-苄基腺嘌呤、0.2-0.8mg 6-糠氨基嘌呤、0.5mg 1-萘乙酸、4-6g聚乙烯吡咯烷酮、30g蔗糖、4-6g琼脂糖，其余为ms培养基，调ph值至5.8-6.0。黑暗培养(完全黑暗，培养温度为23-25℃)48-72h后，转移至光照培养(光照强度2500-3500lux，培养温度为23-25℃，12h光照/12h黑暗交替进行)。

4、(3)不定芽的分化：愈伤组织在上述(2)中光照条件继续培养至愈伤组织分化出小芽。

5、(4)不定芽的增殖：利用无菌解剖刀将分化获得的不定芽连同愈伤组织割下，转移至增殖培养基中进行不定芽的增殖培养，所述的增殖培养基每升含1.5-2.5mg 6-苄基腺嘌呤、0.5-1.5mg 6-糠氨基嘌呤、0.2-0.6mg 1-萘乙酸、4-6g聚乙烯吡咯烷酮、30g蔗糖、4-6g琼脂糖，其余为ms培养基，调ph值至5.8-6.0。光照培养条件与上述(2)中光照培养相一致。

6、(5)生根培养：将上述(4)中增殖后的掌叶覆盆子小苗，转移至生根培养基中，所述的生根培养基每升含0-1.0mg吲哚-3-丁酸、30g蔗糖、4-6g琼脂糖，其余为1/2ms培养基，调ph值至5.8-6.0。光照培养条件与上述(2)中光照培养条件相一致。

7、(6)组培苗的移栽：当掌叶覆盆子组培苗高达3-4cm时，在自然光照下闭瓶炼苗5-7天，继续开瓶炼苗3-5天，随后取出组培苗，洗净根部残留的培养基，移栽至泥炭土:珍珠岩＝(2-4):1(v/v)的混合基质中，遮荫、浇水、保湿和保温；

8、(7)病毒检测：采用酶联免疫吸附法(elisa)检测待出瓶的掌叶覆盆子组培苗进行烟草花叶病毒(tmv)、黄瓜花叶病毒(cmv)、菜豆黄花叶病毒(bymv)和黄斑驳病毒(caymv)检测，获得无病毒感染的掌叶覆盆子组培苗。

9、优选，选择3-7片新生叶作为外植体，采用75％乙醇溶液擦拭叶表面，随后浸泡于75％乙醇溶液20-40s，无菌水洗涤3-5次，再浸泡于0.1％升汞溶液6-8min，无菌水洗涤3-5次。

10、优选，诱导培养基每升含2-4mg 6-苄基腺嘌呤、0.2-0.8mg 6-糠氨基嘌呤、0.5mg1-萘乙酸、4-6g聚乙烯吡咯烷酮、30g蔗糖、4-6g琼脂糖，其余为ms培养基，调ph值至5.8-6.0。

11、优选，黑暗培养条件，为23-25℃下完全黑暗培养48-72h。光照培养条件，为光照强度2500-3500lux、23-25℃、光照与黑暗交替进行，光照时间12-16小时。

12、优选，增殖培养基每升含1.5-2.5mg 6-苄基腺嘌呤、0.5-1.5mg 6-糠氨基嘌呤、0.2-0.6mg1-萘乙酸、4-6g聚乙烯吡咯烷酮、30g蔗糖、4-6g琼脂糖，其余为ms培养基，调ph值至5.8-6.0。

13、优选，生根培养基每升含0-1.0mg吲哚-3-丁酸、30g蔗糖、4-6g琼脂糖，其余为1/2ms培养基，调ph值至5.8-6.0。

14、优选，所获得的生根组培苗，在自然光照下闭瓶炼苗5-7天，继续开瓶炼苗3-5天，随后取出组培苗，洗净根部残留的培养基，移栽至泥炭土:珍珠岩＝(2-4):1(v/v)的混合基质中。

15、优选，所述的病毒检测是采用酶联免疫吸附法检测将出瓶的掌叶覆盆子组培苗。

16、优选，所检测的病毒包括烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和黄斑驳病毒。

17、本发明以毛刺少、山奈酚-3-o-芸香糖苷含量高的掌叶覆盆子植株上正常生长、无病害的第3-7片新生叶为外植体，通过无菌外植体的获取及消毒措施、愈伤组织的诱导、不定芽的分化、不定芽的增殖、生根培养、组培苗的移栽和病毒检测等阶段，选择各培养阶段适宜的培养基配方和培养条件，成功地进行了掌叶覆盆子优质种苗的组织培养，繁育出优质的掌叶覆盆子无毒种苗以满足市场或科学研究的需求。

18、本发明技术简单便捷，切实可行，应用价值高。实施该发明只需有简单的植物组织培养设备即可进行。