一种应用桑酮G抑制单增李斯特菌的方法及应用

本发明属于日常杀菌消毒，具体涉及一种应用桑酮g抑制单增李斯特菌的方法及应用。

背景技术：

1、单核细胞增生性李斯特菌（ listeria monocytogenes，lm）简称单增李斯特菌，为兼性厌氧革兰氏阳性无芽孢杆菌李斯特菌属，是一种普遍存在人畜共患的四大食源性致病菌之一。它能够在低温、低酸和高盐在内的大范围不利环境条件下增殖，并且能导致严重的人类疾病，如败血症、脑膜炎、以及怀孕期间的严重并发症(流产和死产)，其死亡率可达20%-30%。虽然单增李斯特菌耐药性在全球范围内处于较低水平，随着抗生素在人类和动物中的长期使用和滥用，现在越来越多的国家报告了单增李斯特耐药菌株。

2、冰箱冷藏室是人们经常使用的食物保存容器，也是非常容易滋生单增李斯特菌的地方，由于单增李斯特菌的危害，因而需要定期清除其中的李斯特菌，而普通抗生素的使用不仅容易产生耐药性，效果不尽人意，还会对保存冰箱里面的食物造成污染。

技术实现思路

1、为克服现有技术的不足，本发明通过大量研究，在首次发现桑酮g对单增李斯特菌有较强杀菌性能的基础上，发明出一种应用桑酮g抑制单增李斯特菌的方法及应用。

2、本发明的一种应用桑酮g抑制单增李斯特菌的方法采用以下步骤：

3、将桑酮g配制成浓度不低于4μg/ml的溶液或混悬液，再将这种溶液或混悬液与单增李斯特菌接触，即可实现对单增李斯特菌的抑制，

4、如果是对冰箱冷藏室中的单增李斯特菌进行清除，则可将一定量的桑酮g和水放入喷壶中搅拌或震荡，配制成不低于4μg/ml的溶液或混悬液，再将喷壶对准冰箱冷藏室喷洒即可。

5、桑酮g还可制成乳剂、口服制剂等多种形式的药物，用来治疗感染无乳链球菌相关的疾病，也可制成消毒制剂用来杀灭单增李斯特菌。

6、本发明是建立在发现桑酮g对单增李斯特菌有较强杀菌性能的基础上，并测定桑酮g对单增李斯特菌mic和mbc，研究桑酮g对单增李斯特菌生长曲线的作用，研究桑酮g对单增李斯特菌细胞形态的影响，最终做出的，结果虽较为简单，但耗费了大量的精力和创造性劳动。

7、桑酮g（kuwanon g）是从桑树的桑白皮中提取出来的一种黄酮类化合物，桑白皮是桑科桑属植物桑（morus alba l.）的根皮，又名白桑皮、桑根白皮。桑是药食兼用的功能植物，在东西方都作药用。在中国，桑入药可上溯到《神农本草经》，以后历代本草经均有记载。虽然桑酮g对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、枯草芽孢杆菌和某些霉菌具有很强的抗菌活性，还具有抗炎、降压、抑制酶活性和降低血糖等。但有关桑酮g对单增李斯特菌的抗菌效果及抗菌机制的国内外文献均未报道，现有技术也无法预见桑酮g对单增李斯特菌的杀灭和抑制效果，因而我们研究了桑酮g对单增李斯特菌的抗菌效果及抗菌机制。

8、材料与试剂：李斯特氏菌atcc19115，中国菌种保藏中心；脑心浸液肉汤培养基（brain heart infusion，bhi），广东环凯微生物科技有限公司；桑酮g（kuwanon g），其纯度大于99％。细菌蛋白提取试剂盒：bacterial protein extraction kit，上海生工；其余试剂均为分析纯。

9、主要仪器与设备：高压蒸汽灭菌锅：zealway，中科星宇科技发展有限公司；生化培养箱：spx型，杭州硕联专业仪器厂；振荡摇床：sy-2230，上海精骐公司；紫外分光光度计，biospectrometer-d30，广州雷得生物技术有限公司；德国卡尔蔡司场发射扫描电子显微镜，型号sigma hd。

10、菌液和药液制备：菌悬液制备：将甘油冷冻保藏的单增李斯特菌接种于灭菌的bhi肉汤培养基中，37 ℃培养16 h至对数期，用bhi培养基校正菌液浓度至1×108 cfu/ml，4℃冰箱保存备用。以二甲基亚砜作溶剂将桑酮g配置成浓度为1024 μg/ml的母液。

11、桑酮g对单增李斯特菌最小抑制浓度（mic）和最小杀菌浓度（mbc）的测定：依据临床和实验室标准协会（clsi）方法，采用微量稀释法在96孔板中测定。无菌96孔板第一列加入200 μl浓度为1 024 μg/ml的桑酮g，通过加bhi培养基用二倍稀释梯度法使药物质量浓度依次为2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024 μg/ml，最后加入100 μl菌悬液。另外加200μl菌悬液作为阳性对照组；加200 μl培养基作为阴对照组。37 ℃摇床培养24 h，肉眼观察培养液澄清者所对应的最低浓度即为受试药液的 mic。在最小抑菌质量浓度试验基础上，从无明显细菌生长的孔板中取100 μl涂布于bhi平板培养基上，放于37 ℃培养箱中培养24h后观察结果。以平板培养基上无菌落生长的最低药物浓度作为最小杀菌质量浓度（mbc）。

12、经实验测得，桑酮g对单增李斯特菌的mic是4 μg/ml，mbc是16 μg/ml。结果表明桑酮g对单增李斯特菌有较强的杀菌性能。

13、桑酮g对单增李斯特菌生长曲线的影响：实验方法同mic和mbc测定方法一样，药物浓度以1/2 mic、mic、2 mic和不加药组来研究桑酮g对单核李斯特菌生长曲线的影响。将以上培养物置于37 ℃，180ｒ/min的摇床中培养，分别在2、4、6、8、10、12、16、24、36 h时取样，于紫外分光光度计测定其od600 nm的吸光度值。以时间为横坐标，吸光光度值为纵坐标，绘制桑酮g对单增李斯特菌时间剂量效应曲线。

14、桑酮g对单增李斯特菌生长曲线的影响的实验结果如图1，用od600吸光度法是研究液体培养基中微生物生长的方法之一。单增李斯特菌经过桑酮g作用后生长曲线变化明显，且随着药物浓度增加，对单增李斯特生长的影响也越大。桑酮g在低浓度时就能抑制细菌生长，延迟细菌对数期的到来且始终小于空白对照组菌浓度；当桑酮g浓度为mic时，发现桑酮g对单增李斯特菌的生长活性具有明显的抑制作用；而当菌液中药物浓度为2 mic时，菌液od值未有增加趋势，表明桑酮g能完全抑制单增李斯特菌的生长。

15、桑酮g对单增李斯特菌蛋白质合成影响：菌悬液用不同浓度桑酮g处理使其达到mic、2 mic和空白对照组，37 ℃振荡培养16 h至对数生长后期，8 000 r/min离心10 min，用无菌pbs(0.1 mol/ml、ph=7.4)洗涤三次，按照细菌蛋白提取试剂盒（bacterial proteinextraction kit，上海生工）中所述的方法来提取蛋白质。随后取15 μl样品进行sds-page电泳，电泳结束后凝胶用考马斯亮蓝r250染色过夜，然后脱色4-8 h，最后用凝胶成像仪拍照。

16、图2表示桑酮g对单增李斯特菌细胞蛋白合成的影响，对分子量在10 kda-75 kda的单增李斯特菌细胞蛋白进行sds-page电泳分析。结果表明，空白对照组条带清晰且明亮，不同浓度的桑酮g对单增李斯特菌细胞蛋白合成的影响程度不同，随着桑酮g浓度越高，蛋白条带越少，越不清晰。当桑酮g的浓度为mic时，蛋白条带数量明显减少（实线框所示），只有三条带条带清晰可见，其余的条带基本消失；当桑酮的浓度为2mic时，条带明显变浅（虚线框所示）。说明桑酮g能明显影响单增李斯特菌蛋白质的合成，随药物浓度的增大，对蛋白质的影响越明显。

17、桑酮g对单增李斯特菌细胞形态的影响：对数期的菌悬液用bhi培养基调整到1×108 cfu /ml，添加桑酮g使其终浓度为mic和mbc，以不加桑酮g为空白对照组。摇床(37 ℃、180 r/min)培养至对数生长期，8000 r/min下离心10 min，用无菌pbs洗涤3次，收集菌体后用2.5%戊二醛溶液固定过夜。再依次用30.0%、50.0%、70.0%、90.0%、100.0%乙醇脱水(2次)，干燥，最后喷金制样。

18、图3表示桑酮g对单增李斯特菌细胞形态的影响。空白对照组(图3a)的单增李斯特菌形状为短杆形，菌体表面光滑饱满，细胞之间界限分明，形态正常。加入桑酮g(图3b)的单增李斯特菌细胞膜结构损伤并发现菌体碎片,出现扭曲,细胞形态出现明显变化，以至有些菌体出现细胞断裂。表明桑酮g会破坏单增李斯特菌的细胞膜，从而胞内物质外流，最终死亡。

19、与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是:

20、本发明首次发现了桑酮g对单增李斯特菌有较强的杀菌性能，并测定了桑酮g对单增李斯特菌的mic和mbc，研究了桑酮g对单增李斯特菌生长曲线的作用，研究了桑酮g对单增李斯特菌细胞形态的影响，发明了一种应用桑酮g抑制单增李斯特菌的方法及应用，该方法不仅能简单、快速、有效的清除冰箱冷藏室中的李斯特菌，制备抑制单增李斯特菌相关的药物和消毒制剂，而且不会产生耐药性，还不会对冰箱里面的食物造成污染，填补了一项该领域的技术空白。

21、本研究初步探索了桑酮g对单核李斯特菌的抗菌活性。用微量肉汤稀释法测定桑酮g对单核李斯特菌的最小抑制浓度和最小杀菌浓度分别为4 μg/ml和16 μg/ml，表明在体外桑酮g对单增李斯特菌有较强的抗菌性能。近年来，对天然来源的中药提取物研究发现与传统抗生素抑菌机制明显不同，并且具备不易产生耐药、副作用少和作用靶点多等优点，已成为国内外研究热点。

22、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术研究了桑酮g对单增李斯特细菌蛋白质合成的影响，聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好和迅速等优点，且sds和蛋白质的结合是高密度的，即消除了由于各种蛋白质所带净电荷的不同对电泳迁移率的影响，因而得到了迅速的发展和广泛的应用，目前已成为蛋白质研究的有力工具。由sds-page的结果分析得，未加桑酮g处理菌体的蛋白质谱带与经桑酮g处理菌体的蛋白质菌体有明显的区别，桑酮g质量浓度为mic时，蛋白质谱带显著变少变浅，且随着桑酮g浓度增大对单增李斯特菌蛋白质影响越深，说明桑酮g对单核李斯特菌的蛋白质具有抑制作用。这可能是因为桑酮g影响了菌体蛋白质的正常表达或者是因为蛋白酶不能正常合成、蛋白酶失去了活性等等，从而使得菌体的生长和繁殖受到了较大的影响。蛋白质是生物体重要成分，大多是参与生化反应的酶类，是了解生物代谢繁殖的重要标志之一。

23、通过扫描电镜观察桑酮g对单核李斯特菌形态学的影响，发现经过桑酮g mic处理24h后，单增李斯特菌细胞膜结构损伤，表现为：形态不规则，出现扭曲，甚至塌陷和皱缩。这可能由于桑酮g影响了菌体的细胞膜和细胞质，从而抑制或阻止细胞的生长。

24、综上所述，桑酮g具有较强的抗菌活性，对单核李斯特菌抗菌机制主要通过破坏菌体的细胞膜结构，致使胞内物质外流，影响细菌的正常生长从而导致细菌的死亡。与王帆等人研究的肉桂醛、丁香酚、麝香草酚和单宁酸的对单核李斯特菌的mic相比，桑酮g更加具备开发成为一种抗单增李斯特菌的潜能。而有关桑酮g对单增李斯特菌其他方面的抑菌机制，还需进一步详细研究。所以，桑酮g还可以作为一种潜在的抗菌剂，用于预防由单核李斯特菌感染的相关疾病。