含特基拉芽孢杆菌的杀菌组合物及其增效组合杀菌剂和应用

本发明涉及植物杀菌剂，尤其涉及含特基拉芽孢杆菌的杀菌组合物及其增效组合杀菌剂和应用。

背景技术：

1、番茄灰叶斑病是由茄匐柄霉侵染所引起的、发生在番茄上的病害。该病主要危害叶片，发病初期叶面布满圆形或不正圆形的暗褐色小斑点，呈水浸状，并沿叶脉向四周扩大，发展为不规则形病斑，病斑中部渐褪色为灰白至灰褐色，后期易破裂、穿孔或脱落。番茄灰叶斑病的发生与流行受温度及相对湿度的影响，连阴天、多雾的早晨及温度忽高忽低变化均有利于该病的发生和蔓延，温度20-25℃、相对湿度80％以上时易发病。进入开花结果期的植株，发病快而迅速，多在短时间内致番茄上、下部叶片感病，其发病和损失都比较严重。误诊或防治不及时，常造成番茄减产，一般减产20％左右，严重时甚至可减产80％以上，给种植户造成严重的经济损失。

2、近年来，灰叶斑病已成为对西红柿危害最严重的病害之一，防治难度很大。即便选择防效较高的昂贵药剂并进行多次喷药，都难以彻底控制该病害。化学药剂是防治番茄灰叶斑病最有效的手段，但由于长期不科学的频繁使用导致该病原菌对苯并咪唑类杀菌剂(多菌灵)、琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂(啶酰菌胺)等产生了较强的抗药性，增加了该病的防治难度。在灰叶斑病流行期间，许多抗病毒的番茄品种对番茄灰叶斑病表现出高度的敏感性，造成了该病的流行。

3、氟啶胺(fluazinam)是苯胺类保护性杀菌剂，其作用机制为线粒体氧化磷酰化解偶联剂，即通过抑制孢子萌发、菌丝突破、生长和孢子形成而抑制病原菌的侵染。氟啶胺杀菌谱广，效果优于常规保护性杀菌剂。适用作物广，包括辣椒、大白菜、柑橘、大豆、马铃薯、番茄、草坪等，对灰葡萄孢引起的多种灰霉病有特效，对交链孢属、疫霉属、单轴霉属、核盘菌属和黑星菌属等病菌引起的病害亦有良好的抑制活性。自上世纪80年代投入生产以来，尚未见单独对氟啶胺产生抗性的田间菌株，已有的研究表明，植物病原真菌对氟啶胺的抗药性发展缓慢。且氟啶胺与其它作用机制的杀菌剂无交互抗药性，可以用来治理已有的抗药性风险。但氟啶胺无内吸活性和治疗作用，无法通过植物体表进入植物体内，虽然对很多病原菌有较好的杀菌活性，但单剂在田间实际应用中效果不太理想。

4、氟唑菌酰胺(fluxapyroxad)是羧酰胺类杀菌剂，具有预防和治疗活性，用于防治广谱真菌病害，抑制真菌病原菌孢子的萌发以及芽管和菌丝体的生长。氟唑菌酰胺应用范围广，可用于如小麦、水稻、玉米等谷类作物，马铃薯、向日葵、棉花、大豆等经济作物，番茄、黄瓜、草莓、西瓜、辣椒、菜豆等瓜果蔬菜，用于防治番茄叶斑病、叶霉病、早疫病，西瓜叶枯病、蔓枯病，黄瓜白粉病、灰霉病、白粉病、靶斑病等。该药剂如果长期频繁使用存在产生抗药性的风险。

5、随着人们生活水平的不断提高，对植物进行病害防治时也更加注重生态化。其中生物防治技术是一种无毒无害、不污染自然环境且具有高效特点的病害处理手段。生物防治并非要完全消除病害，而是要在经济手段下将病害的危害控制在最低，以此来降低经济效益损失的目的。为了弥补生物防治与化学防治的不足，开展生防微生物与低毒化学药剂协同控制番茄灰叶斑病的方法，既能发挥化学药剂高效、快速的抑菌作用，又能发挥生防微生物在诱导植物抗病性作用，达到持久防控番茄灰叶斑病的流行的目的。将生物防治与化学防治结合有利于开发满足环境承载力要求的、更优的防治病害方法。

技术实现思路

1、本发明提供含特基拉芽孢杆菌的杀菌组合物及其增效组合杀菌剂和应用。

2、本发明发现，特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)2_2a对氟啶胺或氟唑菌酰胺具有天然抗性，该菌株可以在氟啶胺或氟唑菌酰胺含量为1000μg/ml的lb培养基上生长，因此特基拉芽孢杆菌2_2a与上述化学杀菌剂可以长期共存，可将特基拉芽孢杆菌2_2a与氟啶胺或氟唑菌酰胺复配成杀菌剂，用于植物病害防治。在进一步研究中，本发明意外地发现，将特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)2_2a与氟啶胺和/或氟唑菌酰胺组合使用，特基拉芽孢杆菌2_2a能够与上述化学杀菌剂在抑制茄匐柄霉菌方面产生协同增效作用，极大地提高对茄匐柄霉菌的毒力和抑制效果，由该杀菌组合物制得的增效组合杀菌剂对茄匐柄霉菌感染导致植物病害具有优异的防效。

3、具体地，本发明提供以下技术方案：

4、本发明提供一种杀菌组合物，所述杀菌组合物包括：特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a和杀菌剂；

5、其中，所述特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)2_2a的保藏编号为cgmccno.19446；所述杀菌剂包括氟啶胺和/或氟唑菌酰胺。

6、本发明中，特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)2_2a由河北省农林科学院植物保护研究所筛选获得，并已于2020年3月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为特基拉芽孢杆菌bacillus tequilensis，保藏编号为cgmccno.19446。该菌株已在cn111172084a中公开。该菌株具有高效抑制植物病原菌、抑菌谱广、使用简单、成本低、无环境污染等特点。

7、本技术发现，特基拉芽孢杆菌2_2a对茄匐柄霉也具有抑制作用，并能够在番茄中定殖，用于防治由茄匐柄霉感染导致的番茄灰叶斑病。

8、在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物的活性成分包括特基拉芽孢杆菌2_2a和氟啶胺。

9、在本发明的另一些实施方式中，所述杀菌组合物的活性成分包括特基拉芽孢杆菌2_2a和氟唑菌酰胺。

10、本发明中，所述杀菌组合物的活性成分为杀菌活性成分。

11、优选地，所述杀菌组合物中，特基拉芽孢杆菌2_2a的活菌数与杀菌剂的质量之比为1×108～1×1012cfu:1g。

12、在上述配比范围内，特基拉芽孢杆菌2_2a能够与上述化学杀菌剂产生协同增效作用，极大地提高对茄匐柄霉菌的毒力和抑制效果以及对茄匐柄霉菌感染导致植物病害的防效。

13、进一步优选地，所述杀菌组合物中，特基拉芽孢杆菌2_2a的活菌数与杀菌剂的质量之比为1.6×108～5×1011cfu:1g。

14、上述杀菌组合物中，特基拉芽孢杆菌2_2a包括其菌体或其菌体与其代谢产物的混合物。

15、上述杀菌组合物中，特基拉芽孢杆菌2_2a可以菌粉或发酵液形式提供。

16、在满足上述特基拉芽孢杆菌2_2a的活菌数与杀菌剂的质量之比的情况下，特基拉芽孢杆菌2_2a的质量可根据其菌粉或菌液的活菌数含量进行调整。

17、在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中，杀菌剂与特基拉芽孢杆菌2_2a的质量比为(1-50):(50-1)。

18、在本发明的一些实施方式中，所述特基拉芽孢杆菌2_2a以发酵液形式提供，所述发酵液的活菌总数为(7×109-1×1010)cfu/ml。

19、在本发明的一些实施方式中，所述特基拉芽孢杆菌2_2a以冻干菌粉形式提供，所述冻干菌粉的活菌总数为(1.8×1010-2.4×1010)cfu/g。

20、其中，特基拉芽孢杆菌2_2a发酵液可由现有技术如中国专利cn111172084a记载的方法制得，或者按以下方法制得：首先将特基拉芽孢杆菌2_2a在lb平板中活化，挑取单菌落划线到苛氏瓶中，3天后用无菌水将菌苔洗出接种至种子罐(如1吨罐)作为种子液，31℃培养12h后将种子液接种到发酵罐(如5吨罐)进行发酵，48h结束发酵，即得到特基拉芽孢杆菌2_2a发酵液。

21、特基拉芽孢杆菌2_2a冻干菌粉可由特基拉芽孢杆菌2_2a的发酵液按常规方法制得。例如，将特基拉芽孢杆菌2_2a发酵液离心，收集菌体并冻干，即得到特基拉芽孢杆菌2_2a冻干菌粉。

22、本发明提供以上所述的杀菌组合物在制备杀菌产品或植物病害防治产品中的应用。

23、上述应用中，所述菌优选为茄匐柄霉菌。

24、上述应用中，所述植物病害优选为茄匐柄霉菌引起的植物病害，更优选为为茄匐柄霉菌引起的番茄灰叶斑病。

25、在本发明的一些实施方式中，所述产品为增效组合杀菌剂。

26、本发明提供一种增效组合杀菌剂，所述增效组合杀菌剂包括以上所述的杀菌组合物。

27、优选地，所述杀菌组合物在所述增效组合杀菌剂中的质量百分含量为25％～80％。

28、在本发明的一些实施方式中，所述增效组合杀菌剂的活性成分由所述杀菌组合物组成。

29、进一步地，所述增效组合杀菌剂还含有农药领域允许的助剂或辅料。

30、所述增效组合杀菌剂可为悬浮剂或水分散粒剂，上述剂型可按常规方法制备得到。

31、进一步地，所述增效组合杀菌剂还包含选自稳定剂、分散剂、润湿剂、紫外保护剂、芽孢萌发剂、干燥保护剂、增稠剂、消泡剂、防冻剂、防腐剂、崩解剂、粘结剂、填料中的一种或多种。

32、对于悬浮剂，可使用的助剂包括稳定剂、紫外保护剂、芽孢萌发剂、分散剂、润湿剂、增稠剂、防腐剂、消泡剂、防冻剂中的一种或多种的混合物。

33、其中，稳定剂选自草氨酸乙酯、草氨酸丁酯、香草酸甲酯、香草酸乙酯中的一种或多种的混合物。

34、紫外保护剂包括糊精、羧甲基纤维素、尿素、淀粉、糊精、刚果红、抗坏血酸(vc)、黄原胶、纯牛奶中的一种或多种的混合物。

35、芽孢萌发剂包括丙氨酸、肌苷、果糖、丝氨酸中的一种或多种的混合物。

36、分散剂包括聚羧酸盐、木质素磺酸盐、烷基萘甲醛缩合物磺酸盐、烷基酚聚氧乙烯基醚磷酸酯、烷基酚聚氧乙烯基醚磺酸盐、苯乙基酚聚氧乙烯基醚磷酸酯、烷基聚氧乙烯醚磺酸盐、聚氧乙烯聚氧丙烯基醚嵌段共聚物、拉开粉、十二烷基聚氧乙烯醚磷酸酯等中的一种或多种的混合物。

37、润湿剂包括烷基酚聚氧乙烯基醚甲醛缩合物硫酸盐、苯乙基酚聚氧乙烯基醚磷酸酯、烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基萘磺酸盐、烷基酚甲醛树脂聚氧乙烯醚中、三苯乙基苯酚聚氧丙烯聚氧乙烯嵌段聚合物等中的一种或多种的混合物。

38、增稠剂包括黄原胶、聚乙烯醇、膨润土、硅酸镁铝、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、甲基纤维素等中的一种或多种的混合物。

39、防腐剂包括甲醛、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸钾、异噻唑啉酮等中的一种或多种。

40、消泡剂包括硅油、硅酮类化合物、c10-20饱和脂肪酸类化合物、c8-10脂肪醇类、己醇，丁醇、辛醇等中的一种或多种的混合物。

41、防冻剂包括乙二醇、丙二醇、丙三醇、聚乙二醇、山梨醇、尿素、无机盐类等中的一种或多种的混合物。

42、所述悬浮剂还包括水，优选为去离子水。

43、优选地，所述增效组合杀菌剂为悬浮剂，包括如下重量份的组分：所述杀菌组合物25-50份，稳定剂5-15份，分散剂4-5份，润湿剂3-6份，紫外保护剂0.1-0.2份，芽孢萌发剂0.5-1.0份，增稠剂0.4-0.7份，消泡剂1-2份，防冻剂4-5份，防腐剂0.2-0.5份，水28-50份。

44、对于水分散粒剂，可使用的助剂包括紫外保护剂、芽孢萌发剂、干燥保护剂、分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、填料中的一种或多种。

45、其中，紫外保护剂包括抗坏血酸(vc)、卵磷脂中的一种或两种的混合物。

46、芽孢萌发剂包括丙氨酸、肌苷、果糖、丝氨酸中的一种或多种的混合物。

47、干燥保护剂包括麦芽糖、甲基纤维素、蔗糖、甘露醇中的一种或多种的混合物。

48、分散剂包括聚羧酸盐(tersperse2700、t36、gy-d06等)、木质素磺酸盐、聚氧乙烯聚氧丙烯基醚嵌段共聚物、烷基萘甲醛缩合物磺酸盐、烷基酚聚氧乙烯基醚磷酸酯、脂肪醇聚氧乙烯醚磷酸酯、烷基酚聚氧乙烯基醚磺酸盐等中的一种或多种的混合物。

49、润湿剂包括烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、萘磺酸盐、烷基苯磺酸钠等中的一种或多种的混合物。

50、崩解剂包括硫酸铵、硫酸钠、尿素、碳酸氢钠、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉及其衍生物、膨润土等中的一种或多种的混合物。

51、粘结剂包括淀粉、葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、蔗糖等中的一种或多种的混合物。

52、填料包括硅藻土、高岭土、白炭黑、轻钙、滑石粉、凹凸棒土、陶土等中的一种或多种的混合物。

53、优选地，所述增效组合杀菌剂为水分散粒剂，包括如下重量份的组分：所述杀菌组合物50-80份，分散剂5-10份，润湿剂3-10份，紫外保护剂1-1.5份，芽孢萌发剂0.5-1.5份，干燥保护剂2-5份，崩解剂1-2份，粘结剂1-2份，填料5-35份。

54、本发明提供以上所述的杀菌组合物或所述增效组合杀菌剂在植物病害防治中的应用。

55、优选地，所述植物病害为茄匐柄霉菌引起的植物病害；更优选为茄匐柄霉菌引起的番茄灰叶斑病。

56、本发明提供以上所述的杀菌组合物或所述增效组合杀菌剂在抑制植物病原菌中的应用。

57、优选地，所述植物病原菌为茄匐柄霉菌。

58、本发明提供一种防治植物病害的方法，所述方法包括：将所述杀菌组合物或所述增效组合杀菌剂施用于植物。

59、优选地，所述植物包括但不限于蔬菜和果树，例如番茄、莴苣、辣椒、甘蓝、蕹菜、空心菜、大蒜、甜菜、苜蓿、生菜、洋葱、茄子、冬枣等多种植物；优选为番茄。

60、优选地，所述植物病害为茄匐柄霉菌引起的植物病害；更优选为茄匐柄霉菌引起的番茄灰叶斑病。

61、上述杀菌组合物或上述增效组合杀菌剂对番茄灰叶斑病的防治具有显著效果，防治效果均可达90％以上。

62、优选地，所述方法包括：将所述增效组合杀菌剂稀释(例如用水稀释)后对所述植物(例如番茄)的茎叶进行喷雾；优选在所述植物(例如番茄)的生长期进行施用。

63、优选地，所述增效组合杀菌剂在使用时其有效成分含量至少为200μg/ml；优选为300μg/ml-700μg/ml。

64、本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。

65、本发明的有益效果至少包括：本发明通过将对人畜安全、对茄匐柄霉菌具有抑制作用的特基拉芽孢杆菌2_2a与低毒化学杀菌剂氟啶胺或氟唑菌酰胺按一定比例复配，实现了特基拉芽孢杆菌2_2a与化学杀菌剂的优势互补，减少了化学杀菌剂的用量，延缓了抗药性的发生和发展；特基拉芽孢杆菌2_2a与氟啶胺或氟唑菌酰胺在抑制茄匐柄霉菌方面产生了协同增效作用，在显著提高茄匐柄霉菌引起植物病害的防治效果的同时，改善了生态环境、降低了化学药剂的残留，在茄匐柄霉菌引起的植物灰叶斑病等植物病害防治中具有较好的应用前景。