一种南药岗梅优树组培苗培育的方法与流程

本发明涉及南药岗梅组织培养，具体涉及一种南药岗梅优树组培苗培育的方法。

背景技术：

1、岗梅(ilex asprella(hook.etarn.)champ.ex benth.)为冬青科冬青属植物，又名秤星树、梅叶冬青。主要分布于广东、广西、江西、福建等地。以根、叶入药，有清热解毒、生津止渴、消肿散瘀的功效，用于感冒发热、口渴、咽喉肿痛等症，是不可替代的配方药材。

2、岗梅原始生境为海拔400～1000m的山地疏林中或路旁灌丛中，应用岗梅作为橡胶树林下栽培树种，可在保证橡胶树正常生长采胶前提下，迅速有效提升橡胶林地经济效益，利于生态橡胶园建设，具备良好的推广应用前景。

3、岗梅现行繁殖方法主要为种子播种实生苗，但是岗梅种子细小、采种制种困难、且种子发芽率极低，导致岗梅繁殖率低；其次，异花授粉植物实生苗性状分离，苗木定植后生长参差不齐，影响产量和品质的稳定性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于避免现有技术中的不足之处而提供一种岗梅优树组培苗培育的方法，该方法能够稳定地繁殖出品质优异的岗梅，具有可操作性强和成本低的优点，实现岗梅优势单株无性系化、苗木快速繁殖、苗木均一稳定、适合集约化经营。

2、为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

3、提供一种岗梅优树组培苗培育的方法，包括以下步骤：

4、s1、优树获得与甄别：选择岗梅优势单株，以原始采穗树作为外植体母树；

5、s2、外植体采集及消毒：在母树主干离地一定高度处截枝，所得截枝培养时间为35～45天，当培养的截枝主干腋芽及不定芽萌发成枝且枝条生长至8～12cm，将枝条剪下，保留枝条上的叶柄，剪除叶片，所得带叶柄枝条为外植体；将外植体消毒，然后切分为带芽段，将所述带芽段继续切割和消毒，使带侧芽或顶芽的枝段接种于不含激素的改良ms培养基中，得到外植体枝段；

6、s3、外植体培养及丛生芽诱导：将所述外植体枝段转移至启动培养基，直至外植体枝段侧芽萌发，将外植体枝段切割为带一个侧芽或顶芽的节段，将所述节段接种至启动培养基进行重新培养，使所述节段侧芽或顶芽长高，得到节段的腋芽萌发形成带3～5个芽的丛生芽；

7、s4、丛生芽继代增殖：将所述丛生芽接种至改良继代培养基进行继代增殖培养，随后将丛生芽切割为带若干个芽的第一小丛，将所述第一小丛转接至相同培养基，重复继代培养若干次，获得增殖丛生芽；

8、s5、壮苗培养：将所述增殖丛生芽切分成带若干个芽的第二小丛，随后将所述第二小丛接种于改良壮苗培养基进行培养，直至第二小丛的小芽长高，获得高3～4cm的粗壮单芽，其中，部分单芽的基部腋芽萌发；

9、s6、生根培养：将所述单芽端部2～2.5cm处切下，接种生根培养基，其中，部分基部带有小芽的单芽接种至壮苗培养基，待小芽形成高3～4cm的粗壮单芽再接种生根，第二次接种生根后剩余部分淘汰；当单芽基部切口附近区域形成突起的白色根原基，根源基发育为完整根系，获得生根苗；

10、s7、生根苗炼苗：将所述生根苗置于炼苗棚进行炼苗，炼苗完成，获得植株高度4～5cm，主根5～8条，主根长度至0.5～1.0cm的苗木；

11、s8、穴盘苗培育：洗净所述苗木根部的培养基，使用浸泡液浸泡苗木，移栽至穴盘培养，获得健壮的穴盘苗；

12、s9、杯苗培育及侧芽促萌：将所述穴盘苗控水至叶片轻度失水，即移栽至育苗杯进行育苗，杯苗定植完成后加强水肥管理，促进壮苗培育，直至达到现行出圃标准。

13、在一些实施方式中，所述s1中，所述优树为引进种子苗起源的岗梅优势单株，所述岗梅优势单株置于种质资源圃，通过扦插方式扩繁，开展品比试验，选择无性繁殖一代稳定表现采穗树性状、粗生速生、成枝力强、一致性好的品系。

14、在一些实施方式中，所述s2中，在8月中旬，对母树主干离地0.4m高度截断，获得所述截枝；

15、所述外植体消毒的步骤包括：在超净工作台内消毒外植体并切分为带芽段，所述带芽段为带2～4个芽，将所述带芽段置于消毒液饱和漂白粉溶液中浸泡15～25min，无菌水漂洗2～3次，漂洗完成转移至0.1％升汞溶液中浸泡8～12min，使用无菌水漂洗4～5次；

16、消毒完成的带芽段重新切割，将所述带芽段中直接接触升汞溶液的叶柄和枝条切口切短0.3～0.5cm，切割完成的带侧芽或顶芽的带芽段接种于不含激素的所述改良ms培养基，所述改良ms培养基的kh2po4浓度为340mg/l，kno3浓度改良为1400mg/l，ca(no3)2·4h2o浓度708mg/l，省去氯化钙，其余与非ms培养基相同；培养时，所述改良ms培养基加入蔗糖30g/l，卡拉胶6.5g/l，培养前，所述改良ms培养基以121℃消毒20min，培养时间为10～15天，培养温度25～28℃，光照时间每天10～12h，光照强度1200～1500lx，保留未污染的外植体枝段。

17、在一些实施方式中，述s3中，所述改良启动培养基的配方包括改良ms、6-ba1.0mg/l和naa0.1 mg/l，其中改良ms中的kh2po4浓度为340mg/l，kno3浓度改良为1400mg/l，ca(no3)2·4h2o浓度708mg/l，去除氯化钙；培养温度25～28℃，光照时间每天10～12小时，光照强度1200～1500lx，培养时间为15～20天直至所述外植体枝段侧芽萌发；重新培养的时间为28～35天。

18、在一些实施方式中，所述s4中，所述改良继代培养基的配方包括改良ms培养基、6-ba2.0mg/l和naa0.1 mg/l，其中改良ms中的kh2po4浓度为340mg/l，kno3浓度改良为1400mg/l，ca(no3)2·4h2o浓度708mg/l，去除氯化钙；其中，每25～30天重复1次继代培养，将丛生芽切割为带3～5个芽的小丛，转接至相同培养基，重复继代培养6～8次。

19、在一些实施方式中，所述s5中，所述改良壮苗培养基的配方包括改良ms、6-ba0.1mg/l、ad 0.2mg/l和naa0.1 mg/l，其中改良ms中的kh2po4浓度为340mg/l，kno3浓度改良为1400mg/l，ca(no3)2·4h2o浓度708mg/l，去除氯化钙。

20、在一些实施方式中，所述s6中，所述生根培养基的配方包括1/2改良ms、naa0.5mg/l、abt1.0 mg/l、ccc 0.1mg/l和蔗糖20g/l，其中改良ms中的kh2po4浓度为340mg/l，kno3浓度改良为1400mg/l，ca(no3)2·4h2o浓度708mg/l，去除氯化钙；当单芽端部接种至生根培养基8～10天后，基部切口附近区域形成突起的白色根原基；当接种20～25后，根源发育为完整根系。

21、在一些实施方式中，所述s7中，生根苗移炼苗棚温度为22℃～28℃，炼苗时间12～15天，晴天上午9点到下午4点半，炼苗棚棚顶遮阳，其余时间遮阳网全开透光；阴雨天，炼苗棚全天遮阳网全开透光；

22、移栽前2～3天，将生根苗瓶盖打开。

23、在一些实施方式中，所述s8中，所述浸泡液的配方包括10％多抗霉素800～1000倍液和0.25％s-诱抗素1500～2000倍液；浸泡时间为10～15分钟，不经漂洗即移栽；

24、所述移栽至穴盘培养的步骤包括：移栽使用50孔穴盘，基质使用泥炭土、珍珠岩，泥炭土与珍珠岩的体积比为9:1，混合均匀；定植前使用敌磺钠600～800倍液浇透基质，定植完成后使用喷雾器喷洒敌磺钠600～800倍液定根，定植后7～10天使用25％多菌灵600～800倍液、1.8％复硝酚钠1500～2000倍液喷撒植株及基质表面；移栽完成，使用小拱棚覆盖苗床保湿12～15天，其后去除小拱棚，进行正常水肥管理，获得健壮的穴盘苗，其中，穴盘苗生长高度12～15cm，使用12.5％丙环唑乳油1500～1800倍液和磷酸二氢钾800～100倍液，喷雾苗木，以基质表面湿润为度。

25、将所述穴盘苗控水至叶片轻度失水，即移栽至育苗杯进行育苗，杯苗定植完成后加强水肥管理，促进壮苗培育，直至达到现行出圃标准。

26、在一些实施方式中，所述s9中，所述育苗杯装有基质，所述基质的配方包括80％表土、15％泥炭土和5％生物有机肥定植肥；

27、移栽至育苗杯后，浇透定根水，并使用6.25％精甲·咯菌腈1500倍液喷雾至穴盘苗叶片滴水为度；

28、所述加强水肥管理的步骤包括：第1和第4个月分别施用奥绿肥一次，每次每株施用量20～25粒；每半个月，使用冲施肥一次，以基质湿润为度，第1～5个月，使用高氮肥料，第6～8个月使用高磷钾肥料；待苗高70～80cm，基部茎粗0.5cm左右，达到现行出圃标准；

29、在出圃前15～20天，使用侧芽促萌剂喷雾，至下层叶片滴水为度，其中，所述促萌剂配方包括：tdz 10mg/l、6-ba 50mg/l、25％甲哌鎓0.75ml/l、0.25％s-诱抗素1ml/l；

30、出圃前4～5天，在主干50厘米高度打顶，使用1.8％复硝酚钠1500～2000倍液、5％胺鲜酯2000～2500和6.25％精甲·咯菌腈1500倍液喷雾，至叶片滴水为度。

31、本发明一种岗梅优树组培苗培育的方法有益效果：

32、(1)本发明的岗梅优树组培苗培育的方法，以岗梅优株带芽茎段为外植体，在无菌条件下，通过单芽诱导丛生芽，丛生芽增殖，丛生芽壮苗生根形成完整植株，通过打顶和药剂处理，杯苗出圃造林后，能快速形成3～5个长势均匀的侧枝，技术路线简洁，可操作和稳定性强。

33、(2)本发明的岗梅优树组培苗培育的方法，广泛优选岗梅优势单株，验证了无性繁殖一代是否稳定表现采穗树优良性状，淘汰因为环境栽培等因素导致的误选单株；对第一次选出的优株，开展系比试验，选择适应性强、粗生速生、个体间一致性好的株系，作为本发明的原始材料，

34、原始材料选择，克服了现有技术以种子实生苗为原料存在岗梅为异花授粉植物，种子实生苗性状分离导致了规模化栽培中的参差不齐的问题。

35、(3)本发明的南药岗梅优树组培苗培育的方法，在植物组织培养过程中，愈伤组织及胚性愈伤组织均为含水量极高薄壁细胞，在组培环境和激素刺激下，易发生变异；通过单芽诱导丛生芽，丛生芽增殖成苗的方式，避免愈伤组织产生，是目前变异率最低，最为稳妥可靠的方式。通过丛生芽增殖成苗方式，使岗梅优选单株无性系化，保持采穗母树优良性状，有效保证了苗木的遗传稳定性，使苗木均一稳定，为造林整齐度、预期产量及品质奠定了良好基础，具有增殖成苗方式的低变异率的优点。

36、(4)本发明的南药岗梅优树组培苗培育的方法，其通过培养基配方优化、培养环境控制及组培苗生长状态等方面的技术控制，实现了岗梅离体高效再生；只需少量母树萌芽条进入再生环节，即可呈几何倍数增殖，克服了种源数量对出苗数量的限制。本发明月平均增殖倍数5.4倍，平均每株母树可取芽42个，消毒后1个月能正常出芽比例为54％，即可获得有效芽22.68个，以一个有效芽起源的苗木，增殖5个月，即可获得5.45＝4591.65个芽，即平均每株母树，从取芽开始6个月后，理论上可10.41万个芽，且每多增殖1个月，又可增殖5.4倍，是少量优良单株无性系化并大量扩繁的有效手段，具有岗梅离体高效再生的优点。

37、(5)本发明的南药岗梅优树组培苗培育的方法，其实施过程中，每个接种工平均每天可接2500株有效生根苗，以小规模组培厂10人计算，一个月可生产生根苗2500*10*22＝55万株，数量可观；成本测算，每出瓶一株生根瓶苗，成本为0.14元，作为优选无性系，该生产成本在合理范围内；组培环境可控，结合温室，能实现周年生产，克服了种子成熟期短，且需沙藏，集中大量播种而导致人手和场地紧缺的矛盾，循环使用提高了育苗实施的利用率，具有适合集约化育苗的优点。

38、(6)本发明的岗梅优树组培苗培育的方法，其多分枝苗培育，通过优株选育，使用分枝率高(33.33％)的品种作为种源，在杯苗出圃前，使用激素和生长延缓剂处理抑制顶端优势促进侧芽发育，打顶则完全破坏顶端优势，同时使用生长促进剂促使侧芽萌发，在芽点抽枝前出圃避免机械伤害，使组培苗大田移栽后，分枝率达到87.5％，而常规增殖苗为10％以下，本发明的方法明显高于常规增殖苗。

39、(7)本发明的南药岗梅优树组培苗培育的方法，基于发现岗梅病害主要为小孢拟盘多毛孢菌导致的枝枯病、葡萄座腔菌引起的枝枯病、胶孢炭疽菌导致的炭疽病、镰刀菌导致的茎基腐病、子囊菌和藻类共生的地衣病，以上菌类及藻类，均能在组培培养基上萌发生长，本发明的方法在组培过程中予以剔除，对以上病害起到了较好的脱毒效果，有利于岗梅健康种苗生产。

40、(8)本发明的南药岗梅优树组培苗培育的方法，技术工艺流程简单，可操作性强，苗木生长整齐健壮，增殖倍率高且稳定，生根苗移栽成活率高，适合集约化育苗，具备推广优势。