一种红汁乳菇孢子培养物接种培育马尾松菌根苗的方法

本发明涉及食用菌，尤其涉及一种红汁乳菇孢子培养物接种培育马尾松菌根苗的方法。

背景技术：

1、以往培育马尾松菌根苗都是用红汁乳菇的子实体组织分离培养发酵物感染培育，如谭著明在红汁乳菇生物学特性与半人工栽培技术研究中即采用此种方法。或如赵洪等在红汁乳菇菌丝体液体发酵条件的优化研究中采用将采集的新鲜子实体带回实验室，采用组织分离法获得母种，经转接获得一级种。以往组织分离法发酵时间如红汁乳菇菌丝体液体发酵条件的较优组合为碳源为马铃薯粉，浓度为3％；氮源为酵母膏，浓度为0.3％；起始ph值为6.0；发酵时间5d。又如张疏雨在红汁乳菇发酵液抑菌活性初步研究中红汁乳菇发酵环境条件优化结果为：发酵4d。200株/箱3个月的马尾松苗，接种菌剂量超过1000ml箱－1，感染菌根株树比例超过90％，接种效果理想，但菌剂量消耗较大。

2、针对上述问题，本发明提供一种能够缩短制种时间，简化发酵配方，减少接种量，增加菌根苗生产数量，利于工厂化育苗的红汁乳菇孢子培养物接种培育马尾松菌根苗的方法。

技术实现思路

1、为了克服现有技术是菌种培养繁琐耗时长；液体发酵培养基配方复杂；接种量大不易大规模生产操作的缺点，本发明提供一种能够缩短制种时间，简化发酵配方，减少接种量，增加菌根苗生产数量，利于工厂化育苗的红汁乳菇孢子培养物接种培育马尾松菌根苗的方法。

2、一种红汁乳菇孢子培养物接种培育马尾松菌根苗的方法，包括有以下步骤：

3、(1)取红汁乳菇的孢子；(2)将步骤(1)中的红汁乳菇的孢子进行纯化；(3)将步骤(2)中纯化的红汁乳菇孢子进行增菌培养，制成菌种液；(4)对马尾松种子进行催芽育苗；(5)将步骤(3)中制好的菌种液接入步骤(4)中已出苗的马尾松，进而培育成菌根苗。

4、优选的，所述步骤(1)中取红汁乳菇的孢子还包括有以下步骤：

5、首先在红汁乳菇出菇季节，取成熟的，无病虫害的7-8分熟肥壮红汁乳菇子实体(菌盖直径4-5cm)在超净工作台上或接种箱上用经火焰消毒的手术刀或小刀切除菌柄带土基部，再用75％的酒精棉球擦拭菌盖表面及切除剩下的菌柄；其次，将菌盖轻放于直径9cm一次性培养皿中已消毒的直径为7cm的滤纸片上，置20-23℃洁净环境下24h-48h；最后，收集落有孢子的滤纸片，收集时要去掉与菌盖边缘接触的滤纸部分。

6、优选的，所述步骤(2)中孢子纯化还包括有以下步骤：在超净工作台上或已消毒接种箱内将粘附孢子的滤纸片剪成25mm2左右大小接于已倾注消好毒的15mlpda培养基直径9cm培养皿中；然后将接种好的培养皿放入30℃培养箱中闭光培养2d-3d，当滤纸周围呈现乳状菌落再转接一次就可以进行增菌培养。

7、优选的，所述步骤(3)中增菌培养还包括有以下步骤：于超净工作台上或已消毒接种箱内用接种环刮取3-4环红色菌落或者乳白色带绿色荧光菌落并在显微镜下确认有两种菌株即可接种，接入，装有100mlnb(蛋白胨10g；氯化钠5g；牛肉膏粉3g；水1000ml)培养液或gvc培养液(马铃薯30g；葡萄糖2g；水100ml)中，135rpm30℃震荡闭光培养24h-48h后接入900mlnb或gvc培养液135rpm30℃震荡闭光培养24h-48h，制成菌种液。

8、优选的，所述菌种液以15-20ml的量接入500g木屑固体培养基中30℃闭光培养5-7d制成菌种置于5℃冷藏，可保存1个月。

9、优选的，所述步骤(4)中马尾松催芽育苗还包括有以下步骤：

10、(1)催芽：2-3月份将饱满的当年马尾松种子浸泡在0.5％高锰酸钾溶液中20min，然后用清水冲洗干净；消毒后的种子，用30℃温水浸种12h-24h，捞出沥干水后放入25℃培养箱中催芽，(每天用温水冲洗一遍)，5d直至种子80％露白；

11、(2)制作育苗盘：将基质土(网购茶花种植专用土(椰糠丝、泥炭、腐殖土、沙性红土基质构成，ph约6.5))铺入育苗盘，并将已催芽露白拨入装有基质土的育苗盘中，每穴2-3粒，用洒水壶浇透水，盖上椰棕丝(注意椰棕丝不可盖得过厚)，再洒一次水使椰棕丝湿润。将播好种的苗盘放入大棚或育苗棚中待其出苗；出苗后25d施一次0.2％尿素溶液，以后每隔8d施一次0.2％尿素溶液进入苗木木质化期，应停施氮肥，可施0.2％钾肥1-2次。

12、优选的，所述步骤(5)中接种是将制好的菌种液以1ml(1g)[活菌数cfu≥0.2*109/ml(g)]的量接入已出苗30d左右的马尾松(每穴100g基质)；经15d再接种一次马尾松，，方法同上(接种期间勿施肥，接种15d后才可以施肥)，经15d移至装有无菌的松树栽培专用土的大育苗钵中后，再以1ml/株接一次种，进而培育成菌根苗。

13、优选的，纯化后在显微镜下确认有以下两种菌株：(1)类似伯克霍尔德苔藓菌株1s18，大小：平均大小为平均长：1.44μm；宽：0.23μm革兰氏染色阴性高倍镜下运动活泼，间有类似孢子状圆形物；(2)伯克霍尔德稳定菌株14294，大小：平均长：1.031μm；宽：0.23μm革兰氏染色阴性高倍镜下运动活泼。

14、本发明具有如下优点：1、本发明可以缩短制种时间，简化发酵配方，减少接种量，增加菌根苗生产数量，适宜工厂化生产马尾松菌根苗，提高造林成活率，长远看可以带动林下经济增加种植者的收益。

技术特征：

1.一种红汁乳菇孢子培养物接种培育马尾松菌根苗的方法，其特征在于，包括有以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种红汁乳菇孢子培养物接种培育马尾松菌根苗的方法，其特点在于，所述步骤(1)中取红汁乳菇的孢子还包括有以下步骤：

3.根据权利要求1所述的一种红汁乳菇孢子培养物接种培育马尾松菌根苗的方法，其特点在于，所述步骤(2)中孢子纯化还包括有以下步骤：在超净工作台上或已消毒接种箱内将粘附孢子的滤纸片剪成25mm2左右大小接于已倾注消好毒的15mlpda培养基直径9cm培养皿中；然后将接种好的培养皿放入30℃培养箱中闭光培养2d-3d，当滤纸周围呈现乳状菌落再转接一次就可以进行增菌培养。

4.根据权利要求3所述的一种红汁乳菇孢子培养物接种培育马尾松菌根苗的方法，其特点在于，所述步骤(3)中增菌培养还包括有以下步骤：于超净工作台上或已消毒接种箱内用接种环刮取3-4环红色菌落或者乳白色带绿色荧光菌落并在显微镜下确认有两种菌株即可接种，接入，装有100mlnb培养液或gvc培养液中，135rpm30℃震荡闭光培养24h-48h后接入900mlnb或gvc培养液135rpm30℃震荡闭光培养24h-48h，制成菌种液。

5.根据权利要求4所述的一种红汁乳菇孢子培养物接种培育马尾松菌根苗的方法，其特点在于，所述菌种液以15-20ml的量接入500g木屑固体培养基中30℃闭光培养5-7d制成菌种置于5℃冷藏，可保存1个月。

6.根据权利要求2所述的一种红汁乳菇孢子培养物接种培育马尾松菌根苗的方法，其特点在于，所述步骤(4)中马尾松催芽育苗还包括有以下步骤：

7.根据权利要求6所述的一种红汁乳菇孢子培养物接种培育马尾松菌根苗的方法，其特点在于，所述步骤(5)中接种是将制好的菌种液以1ml的量接入已出苗30d左右的马尾松；经15d再接种一次马尾松，方法同上，经15d移至装有无菌的松树栽培专用土的大育苗钵中后，再以1ml/株接一次种，进而培育成菌根苗。

8.根据权利要求4所述的一种红汁乳菇孢子培养物接种培育马尾松菌根苗的方法，其特点在于，纯化后在显微镜下确认有以下两种菌株：

技术总结
本发明涉及食用菌技术领域，尤其涉及一种红汁乳菇孢子培养物接种培育马尾松菌根苗的方法。一种红汁乳菇孢子培养物接种培育马尾松菌根苗的方法，包括有以下步骤：(1)取红汁乳菇的孢子；(2)将步骤(1)中的红汁乳菇的孢子进行纯化；(3)将步骤(2)中纯化的红汁乳菇孢子进行增菌培养，制成菌种液；(4)对马尾松种子进行催芽育苗；(5)将步骤(3)中制好的菌种液接入步骤(4)中已出苗的马尾松，进而培育成菌根苗。本发明可以缩短制种时间，简化发酵配方，减少接种量，增加菌根苗生产数量，适宜工厂化生产马尾松菌根苗，提高造林成活率，长远看可以带动林下经济增加种植者的收益。

技术研发人员：贺谊红,鲁继红,彭卫福
受保护的技术使用者：吉安职业技术学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15