一种三叶青组织培养快速繁殖的方法与流程

本发明涉及组织培养，具体涉及一种三叶青组织培养快速繁殖的方法。

背景技术：

1、三叶青又名有角乌蔹莓、石老鼠，为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤，三叶青在临床上已逐步用于肝癌、肺癌、白血病与艾滋病等疾病的治疗，被称为安全无毒的“植物青霉素”。但是由于人为过度采挖三叶青，加上三叶青对生长环境要求苛刻，三叶青野生资源锐减，已处于濒危状态，同时随着三叶青药用成分更深入的研究与开发，使其野生三叶青远远满足不了市场逐年递增的需求，而利用组织培养技术快速增殖瓶苗，可以在短时期内提供大量种苗。

2、目前已报道的三叶青组织快繁体系中外植体选择、灭菌方式、培养基配方和预期效果等都各不相同，现有的常规灭菌方式灭菌后的外植体内依旧会含有部分细菌，存在灭菌不彻底不充分的问题，从而导致带菌的外植体在培养过程中会污染培养基，影响培养效果，并且常规使用的培养基存在增殖系数较低，生根率低的问题，并且会使培养后的种苗存活率较低。

3、为解决上述工艺难点，本发明研究在提高外植体的灭菌效果，降低培养基污染率的同时提高三叶青丛生芽的增殖系数及生根率的一种三叶青组织培养快速繁殖的方法。

技术实现思路

1、为解决上述工艺难点，本发明研究在提高外植体的灭菌效果，降低培养基污染率的同时提高三叶青丛生芽的增殖系数及生根率的一种三叶青组织培养快速繁殖的方法。

2、一种三叶青组织培养快速繁殖的方法，具体包括以下步骤：

3、s1：外植体的选择及灭菌处理

4、采摘无灾无害的三叶青腋芽茎段，清洗干净后先对其进行初步消毒后在对其进行深层消毒灭菌得到灭菌消毒后的外植体腋芽茎段，将灭菌消毒后的外植体腋芽茎段吸干水分后切段，每段保证含1个腋芽；

5、s2：抗菌剂的制备

6、对纳米氧化锌进行改性后，将改性后的纳米氧化锌、壳聚糖和茶多酚磁力搅拌得到抗菌剂；

7、s3：改良诱导培养基及诱导培养

8、以ms培养基为基本培养基，向ms基本培养基内加入6-ba，琼脂，蔗糖，和抗菌剂，混合均匀灭菌得到改良诱导培养基，将切成小段的外植体腋芽茎段接种到培养基上培养得到诱导培养后的新芽；

9、s4：改良增殖培养基及增殖培养

10、取新鲜香蕉和马铃薯放入破碎机内，再加入椰汁破碎，破碎物内加入活性炭粉末，超声辅助下混合搅拌均匀，得到混合物，以ms培养基为基本培养基，向ms基本培养基内加入ba，naa，pvp和混合物，混合均匀灭菌得到改良增殖培养基，将长有芽的外植体在无菌条件下取出，将芽用解剖刀分开，接种到增殖培养基上培养得到增殖后的三叶青丛生芽；

11、s5：改良生根培养基及生根培养

12、取活性炭颗粒研磨粉碎过筛后得到活性炭粉末，向活性炭粉末内加入蔗糖和纳米二氧化硅混合搅拌均匀，得到混合物，以1/2ms培养基为基本培养基，向1/2ms基本培养基内加入iba，naa和混合物，混合均匀灭菌得到改良生根培养基，将丛生芽接种到生根培养基上培养得到已生根的三叶青植株；

13、s6：三叶青苗的移栽

14、将已生根的三叶青植株培养基在自然环境下放置一段时间后，将放置好的三叶青植株苗取出，将三叶青植株基部清洗干净后，将三叶青植株苗移栽到珍珠岩与泥炭土混合基质上培养一段时候后移栽到大田内即可。

15、进一步地，步骤s1外植体的选择及灭菌处理，具体包括以下步骤：

16、s1.1：采摘无病虫害、无病菌侵染的生长健壮的10-20株三叶青腋芽茎段，带回备用；

17、s1.2：将带回的腋芽茎段用洗洁精清洗干净，在流水下冲洗20-30min，使用无菌水清洗2-3次后，放置在1-2mmol/l乙二胺四乙酸二钠溶液内清洗5-10min，再用无菌水浸泡10-20min，晾干、紫外灭菌20-30min，得到初步灭菌的腋芽茎段；

18、s1.3：将初步灭菌的腋芽茎段放置在70-75％乙醇溶液内，浸泡10-15s，用无菌水冲洗干净后，将腋芽茎段放入2-3％的次氯酸钠溶液中消毒15-20min，无菌水冲洗干净后，将腋芽茎段放入0.1-0.2％氯化汞溶液内，并加入2～3滴吐温，灭菌处理6-10min，无菌水冲洗2-3次，最后放置到8-10％双氧水内震荡消毒50-60s后，用无菌水清洗干净，得到灭菌消毒后的外植体腋芽茎段；

19、s1.4：将消毒后的外植体腋芽茎段用无菌手术刀切除两端，并用无菌滤纸吸干水分，再用无菌的解剖刀、镊子将其切成小段，每段保证含1个腋芽，备用。

20、进一步地，步骤s2抗菌剂的制备，具体包括以下步骤：

21、s2.1：取10-20重量份无水乙醇，加入2-4重量份纳米氧化锌，超声分散10-20min，向分散液内加入0.1-0.2重量份山梨酸，50-60℃下水浴加热10-20min，离心取沉淀，将沉淀物在50-60℃下真空干燥10-12h，得到改性纳米氧化锌；

22、s2.2：取2-4重量份改性纳米氧化锌，加入5-8重量份壳聚糖和1-2重量份茶多酚，磁力搅拌10-20min，得到抗菌剂。

23、进一步地，步骤s3为改良诱导培养基及诱导培养，具体包括以下步骤：

24、s3.1：以ms培养基为基本培养基，向ms基本培养基内加入0.5-1.0mg/l6-ba，7-8g/l琼脂，25-30g/l蔗糖，0.1-0.5mg/lnaa和1-2g/l抗菌剂，混合均匀，得到改良诱导培养所需的培养基；

25、s3.2：将诱导培养的培养基在120-125℃下高压灭菌15-20min得到改良诱导培养基；

26、s3.3：将切成小段的外植体腋芽茎段接种到培养基上，培养室的温度为25-28℃，光照强度为35-40μmol.m-2.s-1，培养15-20天，得到诱导培养后的新芽。

27、进一步地，步骤s4改良增殖培养基及增殖培养，具体包括以下步骤：

28、s4.1：取10-20g新鲜香蕉和5-10g马铃薯放入破碎机内，再加入80-90ml/l椰汁破碎，得到混合破碎物，将活性炭颗粒研磨粉碎得到活性炭粉末，向混合破碎物内加入1-2g/l活性炭粉末，超声辅助下混合搅拌均匀，得到混合物；

29、s4.2：以ms培养基为基本培养基，向ms基本培养基内加入0.5-1.0mg/lba，0.1-0.2mg/lnaa，0.5-1g/lpvp，2-4g/l混合物，混合均匀，得到增殖培养所需的增殖培养基；

30、s4.3：将增殖培养的培养基在120-125℃下高压灭菌15-20min得到改良增殖培养基；

31、s4.4：将长有芽的外植体在无菌条件下取出，将芽用解剖刀分开，接种到增殖培养基上，培养室的温度为25-28℃，先暗培养5-10天，再在光照强度为35-40μmol.m-2.s-1下培养20-25天，得到增殖后的三叶青丛生芽。

32、进一步地，步骤s5改良生根培养基及生根培养，具体包括以下步骤：

33、s5.1：取1-2g活性炭颗粒研磨粉碎过筛后得到活性炭粉末，向活性炭粉末内加入15-20g蔗糖和200-230mg纳米二氧化硅混合搅拌均匀，得到混合物；

34、s5.2：以1/2ms培养基为基本培养基，向1/2ms基本培养基内加入1-2mg/liba，0.2-0.5mg/lnaa和15-20g/l混合物，混合均匀，得到生根培养所需的培养基；

35、s5.3：将生根培养的培养基在120-125℃下高压灭菌15-20min得到改良生根培养基；

36、s5.4：将丛生芽接种到生根培养基上，培养室的温度为25-28℃，光照强度为35-40μmol.m-2.s-1下培养30-40天，得到已生根的三叶青植株。

37、进一步地，步骤s6三叶青苗的移栽，具体包括以下步骤：

38、s6.1：将已生根的三叶青植株培养基在自然环境下放置5-6天，向培养基表面洒点水后，再放置1-2天；

39、s6.2：将放置好的三叶青植株苗取出，将三叶青植株基部清洗干净后，将三叶青植株苗移栽到珍珠岩与泥炭土混合基质上，保持环境相对湿度培养28-30天，最初12-14天避免直射光照射；

40、s6.3：28-30天后将三叶青植株苗移栽到大田内即可。

41、进一步地，步骤s1.1中三叶青的品种为中泽1号。

42、进一步地，步骤s6.2中环境相对湿度在70-80％

43、进一步地，步骤s6.2中珍珠岩与泥炭土混合比例为1:1-2。

44、有益效果是：1、本发明通过乙二胺四乙酸二钠溶液和紫外灭菌对腋芽茎段进行初步灭菌，然后采用先次氯酸钠溶液消毒，再通过氯化汞溶液消毒灭菌，最后通过双氧水内震荡消毒的复合消毒方式进行深层消毒，从而提高腋芽茎段的消毒效果，避免腋芽茎段污染培养基。

45、2、本发明通过在诱导培养基内加入抗菌剂得到改良诱导培养基，改良诱导培养基起到一定抗菌作用，通过用改良诱导培养基培养的腋芽茎段，可以减少腋芽茎段污染培养基的概率，降低污染率，同时壳聚糖与茶多酚在抗菌的同时还可以促进腋芽茎段的生长发育。

46、3、本发明通过改良增殖培养基可以促进三叶青植株的生长发育，活性炭颗粒可吸附植株分泌的有害物质，椰汁能有效避免在增殖过程中高细胞分裂素情况下的玻化率，香蕉与马铃薯为三叶青植株提供所需的营养成分，促进其生长，并且提高移三叶青植株苗移栽的成活率，同时提供增殖的暗环境有利于三叶青植株的增殖及生长。

47、4、本发明通过加入活性炭颗粒和纳米二氧化硅可以促进三叶青植株的生根，纳米二氧化硅能够促进组织生长、器官发生，并改善植株的形态、从而提高三叶青植株的生根率，活性炭颗粒吸附植株分泌的有害物质的同时可以诱导三叶青植株的生根，通过加入活性炭颗粒和纳米二氧化硅产生协调作用，使其三叶青植株的生根率得到大幅度提高，并且可以提高移三叶青植株苗移栽的成活率。