一种穗颈瘟人工接种方法及其应用

本发明属于作物病害与保护，具体涉及一种穗颈瘟人工接种方法及其应用。

背景技术：

1、稻瘟病是一种具有高度传染性的病害，稻瘟菌通过孢子附着在稻谷上并侵入植物组织内部，释放毒素和酶类引起稻谷减产和质量下降。病害可在水稻生长各个时期发生，其中穗颈瘟一般发生在水稻孕穗末期至齐穗期，穗颈瘟发病后，整个穗子会因为穗颈节坏死，导致水分、养料输送不上，而出现白穗空壳或瘪粒，甚至整个稻谷田地可能会遭受大面积死亡和凋萎，极大地影响农业可持续发展和粮食安全。

2、目前，生产上对该病害的控制以化学药剂为主。综合研究表明，选用抗穗颈瘟品种或筛选抗病相关基因是解决该病害的最佳途径之一。对水稻品种进行抗瘟性鉴定是抗病育种及新品种抗瘟性鉴定的重要环节，水稻穗颈瘟鉴定技术主要有田间诱发、病圃诱发和人工接种鉴定，其中自然诱发受气候条件等环境因素的影响较大，而人工接种保湿鉴定则极大提高了鉴定结果的准确性。目前，穗颈瘟人工接种鉴定技术主要采用注射、带菌剪穗、喷雾、吸管滴液接种和湿棉球包穗等常规技术手段，其中人工注射法容易造成水稻病情指数显著偏高，造成实验数据出现较大差异性；带菌剪穗法的成功率较低，且易引入未知病原体感染；而喷雾法和其他人工接种方法具有较高的保湿性要求，受外界环境影响较大，对实验操作存在较大的限制。

3、综上所述，上述各种接种方法均存在一定弊端，因此探寻简单高效、稳定可靠、能够正确反映品种抗病性的人工接种方法对穗颈瘟病的抗病性鉴定研究具有重要意义。

技术实现思路

1、为克服现有技术的缺点和不足，本发明提供了一种穗颈瘟人工接种方法及其应用，本发明方法避免了注射人工接种法易造成水稻病情指数显著偏高的差异性，及喷雾法等其他人工接种法中对保湿条件高要求的制约性，同时保留了原有野生稻瘟病菌株的菌株群体构成和田间侵染能力的原始性。

2、本发明的首要目的在于提供一种穗颈瘟人工接种方法，包括以下步骤：

3、s1：接种器具准备：采用普通塑料培养皿作离体培养用工具，用高压灭菌锅于121℃下灭菌20min，获得干燥灭菌塑料培养皿；

4、s2：接种前预处理：按常规技术手段培育水稻苗，常规水肥管理，育苗后，获得水稻苗，将水稻苗移栽于室温下，且环境中无稻瘟病孢子的圆形盆栽中进行栽种，每盆盆栽分散移栽3～4穴，每穴2～3株，采用菜园土作为盆栽种植土壤，待水稻苗缓苗后，进入分蘖期，形成分蘖期水稻，保持分蘖期水稻的水层3～5cm，并对分蘖期水稻施用一次药剂和氮肥，待分蘖期水稻长至破口前3~5d，进入孕穗期，形成孕穗期水稻，在孕穗期水稻的穗上方0.45～0.5m处覆盖黑色遮阴网，继续培育孕穗期水稻，生长出水稻穗苞；

5、s3：接种体制备：采集田间新鲜的稻瘟病叶瘟病样，在水稻叶的病健交界处剪下0.5～1cm的叶瘟病叶段，用无菌干燥容器带回，用清水轻轻冲洗干净叶片表面，放入步骤s1中获得的干燥灭菌塑料培养皿上，27℃恒温保存；

6、s4：接种：叶瘟病叶段插入水稻穗苞前提前1d对步骤s2中培育出的水稻穗苞进行喷洒消毒处理，使用细头灭菌镊子将步骤s3中制备的叶瘟病叶段插入步骤s2中所培育的水稻穗苞中上部内，病叶段的反面与水稻穗苞内的幼穗接触，正面朝外，向水稻穗苞内喷入适量的无菌水，将水稻穗苞恢复成原有状态；

7、s5：接种管理：将接种后的水稻置于自然环境中，同时每天早中晚自动雾化喷淋水稻植株1次，共计3次，每次喷淋时间30～45s，连续喷淋7天。

8、进一步地，步骤s2中所述叶瘟病叶段在64～80倍体式显微镜下，可观察到在叶片正面生长有稻瘟病菌透明、细长、单枝的分生孢子梗，3～5根为一簇，其顶端产生8～10个无色的洋梨形或棍棒形分生孢子。

9、进一步地，步骤s2中所述盆栽直径为30cm，盆栽深度20cm，土壤深度15cm。

10、进一步地，为预防水稻叶瘟病在水稻分蘖期施用一次药剂，步骤s2中所述药剂为春雷霉素、三环唑和肟菌酯•戊唑醇中的一种；所述药剂用量浓度为0.02%，每株水稻喷洒4～8ml；所述氮肥用量为每盆盆栽4～5g。

11、进一步地，步骤s4中所述无菌水用量为每个穗苞内5～10ml，喷洒次数2～3次。

12、需要说明的是，步骤s2中若出现接种前监测到空气稻瘟病菌孢子，则需喷无菌水进行孢子沉降；步骤s3中采集稻瘟病叶瘟病样时，需确保采集前24h无自然降雨，采集时水稻叶片无露珠；步骤s3中叶瘟病样以顶端叶片、梭型、单独的新鲜病斑为宜；步骤s4中接种时最好选择在阴天或下午光照较弱时进行；步骤s4中接种时间为孕穗期或抽穗前期进行比较合适。

13、本发明的另一目的在于提供所述的一种穗颈瘟人工接种方法的应用：

14、1).在水稻中用不同药剂测试对稻瘟病的防治效果；

15、2).在水稻稻瘟病抗性鉴定的应用；

16、根据需要鉴定水稻品种在某一地区的田间抗性选择野生型稻瘟病菌叶瘟病样；预处理，将需要鉴定水稻常规化培育后，移植盆栽培育；接种体制备，选择水稻最顶端病叶的叶瘟病健交界作为接种体，单一叶段放入单一保存，保存1~2d，保证稻瘟病菌孢子的数量、活性以及单一来源；接种，将病变叶段插入预处理培育水稻的穗苞中，恢复穗苞原有状态，继续施用化肥培养。

17、本发明的有益效果：

18、相比于现有技术，本发明采用的穗颈瘟病样人工接种法能够准确评价水稻品种田间抗瘟性，一方面能够避免注射人工接种法易造成水稻病情指数显著偏高的差异性，二是是避免喷雾法等其他人工接种法中对保湿条件高要求的制约性，三是本发明保留了原有野生稻瘟病菌株的菌株群体构成和田间侵染能力的原始性，其接种结果可作为当年当地的水稻抗性评价。

19、本发明提出的病样法人工接种方法可为水稻品种对稻瘟病的抗性鉴定、稻瘟病的致病力测定，及水稻用不同药剂防治效果研究提供重要的技术支持，具有较为广阔的应用前景。

20、本发明方法通过局部接种，使得条件容易控制，从而容易实现技术方法的标准化；同时，该方法具备试验准备简便省时、试验操作简单易行、接种发病过程时间短、占用空间场地少等优点，可作为一种抗性鉴定首选的穗颈瘟人工接种方法。此外，采用该方法接种穗颈瘟在国内外均属首次报道，本发明可有效提升该领域的研究空白。

技术特征：

1.一种穗颈瘟人工接种方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

2.根据权利要求1中所述的一种穗颈瘟人工接种方法，其特征在于：步骤s2中所述药剂为春雷霉素、三环唑和肟菌酯•戊唑醇中的一种；所述药剂用量浓度为0.02%，每株水稻喷洒4～8ml；所述氮肥用量为每盆盆栽4～5g。

3.根据权利要求2中所述的一种穗颈瘟人工接种方法，其特征在于，步骤s4中所述无菌水用量为每个穗苞内5～10ml，喷洒次数2～3次。

4.根据权利要求3中所述的一种穗颈瘟人工接种方法，其特征在于，所述盆栽直径为30cm，盆栽深度20cm，土壤深度15cm。

5.一种根据权利要求1～4任一项所述的穗颈瘟人工接种方法的应用，其特征在于，所述穗颈瘟人工接种方法应用于水稻中不同药剂测试对稻瘟病的防治效果及水稻穗瘟病的抗性鉴定，包括如下步骤：

技术总结
本发明涉及作物病害与保护技术领域，公开了一种穗颈瘟人工接种方法及其应用，其中，方法包括以下步骤：在无稻瘟病孢子环境中培育水稻，分蘖期施用过量氮肥，破口前期覆盖遮阴网；在野外水稻的病健交界处剪成1cm左右的叶瘟病叶段；使用细头灭菌镊子将叶瘟病叶段插入水稻穗苞的中上部内，并向穗苞内喷入适量的无菌水；并提供了其应用。本发明通过局部接种，使得条件容易控制，从而容易实现技术方法的标准化；有效避免喷雾法等其他人工接种法中对保湿条件高要求的制约性，同时保留了原有野生稻瘟病菌株的菌株群体构成和田间侵染能力的原始性，其接种结果可作为当年当地的水稻抗性评价。

技术研发人员：闫晗,董海,王镇,褚晋,徐晗,韩涛,缪建锟,杨皓,张明鑫,白元俊,安福涛,刘兴远
受保护的技术使用者：辽宁省农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25