本发明属于疾病动物模型构建以及疾病防控领域，具体涉及一种斑马鱼成鱼阿尔茨海默症的制备方法及上调xist的应用。
背景技术：
1、阿尔茨海默症(alzheimer’sdisease，ad)，又被称为老年痴呆症，是一种慢性的、发展过程为渐进性的脑部神经退行性疾病，其临床主要表现为记忆力减退，语言障碍，行为失常等症状。阿尔茨海默症主要临床表现为认知功能障碍、行为和精神异常等。其脑内主要病理学特征为：胆碱能神经元丢失，tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结(nft)和β-淀粉样肽蛋白(aβ)沉积形成老年斑(sp)。ad的病理学特征以细胞外老年斑、神经细胞内神经原纤维缠结为主要表现，最终导致海马区神经突触和神经元大量丢失。截至目前，ad的发病机制尚未完全清楚，其主要的病理学特征为乙酰胆碱(ach)水平的缺失，β-淀粉样蛋白(aβ)的沉积和过度的tau蛋白磷酸化等。目前上市的药物主要包括胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐、卡巴拉汀和加兰他敏)和n-甲基-d-天门冬氨酸(nmda)受体拮抗剂(美金刚)。长期临床使用表明，上述药物仅能在短时间内局部缓解ad患者的症状，却并不能阻止和逆转ad的病程。故开发新型的ad治疗药物已迫在眉睫。
2、神经退行性疾病大部分是不可治愈的疾病，这给全世界造成了巨大的健康和社会负担。基于该现状，在世界范围内的掌握神经退行性疾病的发病机制及治疗方法迫在眉睫。近年来在神经退行性病变研究领域，斑马鱼的关注度越来越高，斑马鱼模型虽然与人类中枢神经系统有区别，但是斑马鱼在基本的神经传导系统、神经元和神经胶质细胞类型以及与疾病相关基因同源性上与人类都很相似，所以目前斑马鱼模型在神经退行性疾病生理、病理以及相关药物的研究中发挥着重要作用，并且选用斑马鱼可进行多方面的实验，包括活体检测，多靶点研究，药物的代谢过程，药物前期检测，高通量筛选，行为检测等，这些优点都可以为人类深入研究神经退行性疾病提供一个极具研究意义的方向。
3、斑马鱼，因体侧有像斑马一样纵向的蓝色与银色相间的条纹而得名。斑马鱼作为一种脊椎动物模型，具有物种稳定、个体差异小、发育周期短、繁殖能力强、神经系统发育迅速等特点。大约82％的人类疾病基因在斑马鱼中有同源基因，基因组信号调控也与人类有很高的相似性，可应用于高通量筛选。斑马鱼的大脑拥有哺乳动物大脑中的所有主要结构，斑马鱼的主要神经递质系统，包括去甲肾上腺素能、5-羟色胺能、多巴胺能和组胺能系统，显示出与哺乳动物系统的许多相似性。此外，斑马鱼具有与人类相似的血脑屏障功能。这些都说明了斑马鱼与人类具有高度保守的大脑组织，可用于研究神经退行性疾病，这使得斑马鱼在神经退行性疾病研究中有独特的优势，是理想的模式动物，应用前景广阔，弥补了啮齿动物的不足。
4、研究表明，应用于研究阿尔茨海默病的斑马鱼模型包括突变型appswe、突变型psen1或psen2、tau-p301l-tg斑马鱼，东莨菪碱、蛋白磷酸酶2a抑制剂冈田酸、aβ1-42、铝、氯化铝和氯化铜等物质诱导的阿尔茨海默病模型等。研究者们基于此类模型探究了部分物质抗阿尔茨海默病的药理作用。药理作用的斑马鱼ad模型指的是将斑马鱼暴露于外源性化学物或者与ad发生相关的金属，使其模拟出ad相关症状或者病理改变，从而建立ad模型。已有研究报道在斑马鱼脑组织中发现兴奋性谷氨酰胺和抑制性γ氨基丁酸，除此之外在斑马鱼体内还发现多巴胺、5-羟色胺、组织胺、乙酰胆碱以及以紧密连接为基础的血脑屏障系统，这些发现均为用斑马鱼研究ad奠定了基础。乙酰胆碱是连接中枢神经系统和周围神经系统重要的神经递质，胆碱能系统在学习记忆的过程中起着必不可少的作用。研究发现，由于前脑和海马处胆碱能神经元缺失，使胆碱能系统功能障碍将诱导ad的发生，并且近年来已经出现利用nmda受体拮抗剂来治疗ad。在研究舒必利、奥氮平、氟哌啶醇对斑马鱼脑组织中乙酰胆碱酯酶活性的实验中，学者发现在体外实验时，三种药物均能导致乙酰胆碱酯酶活性降低，而在体内实验中，舒必利、奥氮平并不会影响乙酰胆碱酯酶活性，氟哌啶醇却能够增加乙酰胆碱酯酶活性。这一研究结果表明利用抗精神类药物可以诱发斑马鱼体内乙酰胆碱酯酶的改变，从而引起胆碱能系统相关的分子改变，也为研究ad提供新的思路。有学者将银杏毒素注入斑马鱼幼鱼体内，成功建立了斑马鱼癫痫动物模型。银杏毒素是一种产于银杏树中的天然神经毒素，它可以抑制神经递质γ氨基丁酸的形成。研究人员将斑马鱼幼鱼暴露于银杏毒素中两小时后，发现斑马鱼幼鱼出现癫痫类行为，并且这种行为用常规的抗癫痫药物后可以得到显著的改善，而幼鱼的生理结构和形态学发展变化并没有收到影响。这一研究结果表明用银杏毒素诱发的斑马鱼幼鱼癫痫模型可用来癫痫体内研究，也为研究中枢神经系统疾病提供思路；也有学者将成年斑马鱼浸泡于氯化铝溶液一个月后，斑马鱼出现学习记忆障碍和ad相关症状改变；还有学者将冈田酸作用于斑马鱼，通过免疫组织化学的方法，在斑马鱼脑中可见磷酸化的糖原合酶synthase-3α/β、aβ、p-tau、tau蛋白和老年斑的形成，并且其含量随着冈田酸浓度增加而增加，成功构建了斑马鱼ad模型。
5、但是，目前常用的斑马鱼阿尔茨海默症模型的制备方法存在造模周期长、造模效果不稳定、重复性欠佳、临床症状不够贴近等问题。为了更加有效地深入探索阿尔茨海默症的发生机制，为新药物和干预措施的高通量筛选提供高效的试验基础，亟需一种造模周期短、稳定性和重复性较好、更加贴近临床的斑马鱼阿尔茨海默症模型制备方法。
技术实现思路
1、本研究旨在成功建立一种斑马鱼成鱼阿尔茨海默症模型，并观察动物的神经行为及脑组织病理形态学改变以评价模型的稳定性，目的是制作出高效、稳定性和重复性较好、更加贴近临床的斑马鱼成鱼阿尔茨海默症模型，便于进一步研究阿尔茨海默症的发病机制及其病理生理变化，同时为脑保护干预措施如何实施提供一定的依据。
2、本发明旨在开发一种能够重点针对阿尔茨海默症的经典症状，能够很好的进行针对阿尔茨海默症的药效评价的动物模型。本发明构建的阿尔茨海默症斑马鱼模型在诱发阿尔茨海默症伤经典症状(胆碱能神经元丢失、脑区病理斑块增加、神经细胞内神经原纤维缠结、记忆力减退等)，以及认知功能下降和运动障碍等阿尔茨海默症伴随症状上均表现出较高的成功率和稳定性。本研究能很好的模拟阿尔茨海默症临床发病，为快速筛选治疗药物和干预措施奠定了良好的基础，建模方法效率高、稳定可靠、重复性好、更加贴近临床。
3、本发明是通过以下技术方案实现的：
4、一种斑马鱼成鱼阿尔茨海默症模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5、(1)、硅酸钠暴露：选取同一批次8月龄的成年斑马鱼，体长(3.2±0.56)cm，体重(0.36±0.14)g，暂养于养殖容器中，暂养环境为：ph值为7.0-7.2，盐度为0.03％～0.04％，溶氧量为6.0mg/l，水温26℃，光照/黑夜为14h：10h，每天定时喂食2次。暂养三天开始造模，将斑马鱼转移至造模水缸中，所述造模水缸的养殖水体中添加有硅酸钠，所述硅酸钠在养殖水体中的浓度为0.2～0.5g/l。
6、(2)、头部注射：在造模的第1、3、5天早上，分别向斑马鱼成鱼头部注射1μl海藻酸钠溶液，所述海藻酸钠溶液的浓度为0.05μg/ml；在造模的第2、4、6天早上，分别向斑马鱼成鱼头部注射1μl 3-硝基丙酸溶液，所述3-硝基丙酸溶液的浓度为0.02μg/ml。
7、(3)、黑暗处理：在造模的第2-4天，用黑布罩住造模水缸，保持三天的黑暗养殖环境。
8、(4)、碘乙酸钠投喂：在造模的6天期间，向斑马鱼成鱼的人工饲料中添加碘乙酸钠，所述碘乙酸钠的添加量为饲料重量的3％，每天定时投喂饲料两次。
9、(5)、紫外光照射：在造模水缸内设置紫外灯，所述紫外灯产生的波长350～380nm，造模期间每天上午开启紫外灯30分钟。造模6天后，即可获得斑马鱼成鱼阿尔茨海默症模型。
10、建模结束后，通过t迷宫行为学检测、透射电镜观察脑超微结构、硫磺素s染色、tunel凋亡染色、生化指标检测、rt-pcr检测相关基因表达情况等方面对模型进行评价，结果表明，斑马鱼成鱼出现了典型的阿尔茨海默症症状，符合阿尔茨海默症动物模型可靠性和有效性的判定，即疾病的发病原因、症状表现、病理生理，按照本发明的构建方法，能够成功制备斑马鱼成鱼阿尔茨海默症模型。
11、本发明的技术方案，具有如下优点：
12、1、本发明的阿尔茨海默症斑马鱼模型的构建方法中，通对硅酸钠暴露+头部注射+黑暗处理+碘乙酸钠投喂+紫外光照射，诱导得到斑马鱼阿尔茨海默症模型，这种多因素诱导的阿尔茨海默症与病因学上认为阿尔茨海默症是多因素诱导发生相符，能够更好地模拟人类阿尔茨海默症的特征。本发明非单因素诱导的阿尔茨海默症动物模型，无论是从病理生理理论角度，还是模拟典型临床症状和治疗预测角度，都是较为理想的动物模型，将为阿尔茨海默症的发病机制探索提供支持，并为开发阿尔茨海默症治疗的新方案提供理论依据。
13、2、本发明构建的阿尔茨海默症伤动物模型效率高，效果稳定，个体差异小；多因素之间相互协同，构建的疾病模型更为准确。该模型在诱发阿尔茨海默症经典症状(胆碱能神经元丢失、脑区病理斑块增加、神经细胞内神经原纤维缠结、记忆力减退等)，以及认知功能下降和运动障碍等阿尔茨海默症伴随症状上均表现出较高的成功率和稳定性。
14、3、本发明在制备阿尔茨海默症斑马鱼成鱼模型时对斑马鱼成鱼进行了硅酸钠暴露，硅酸钠可以在一定程度上刺激斑马鱼成鱼的小胶质细胞产生炎性因子和免疫介质，从而产生炎症反应，从而导致神经元凋亡或者死亡。将斑马鱼成鱼连续暴露于硅酸钠溶液中6天，可促进斑马鱼成鱼的神经元凋亡，促进阿尔茨海默症的发生。
15、海藻酸钠能够诱导斑马鱼成鱼的自由基的产生，引起氧化应激，并进一步损伤脂质、蛋白质、dna等生物大分子，从而有利于诱导阿尔茨海默症。3-硝基丙酸可以阻断斑马鱼微管蛋白的组装，抑制微管聚集，解体微管及破坏细胞骨架，造成tau蛋白聚集和神经纤维缠结形成，使神经纤维退化且丧失功能。向斑马鱼成鱼头部注射海藻酸钠和3-硝基丙酸可使得两者的作用相互协同，共同有效地引发神经纤维缠结，不仅巩固加强了硅酸钠暴露的诱导效果，而且进一步加速了阿尔茨海默症的进程。
16、在造模的第2-4天对斑马鱼成鱼黑暗处理，可在一定程度上损伤斑马鱼成鱼的大脑皮层和海马区，降低乙酰胆碱释放量，减少突触后膜接收的信号，进而导致神经系统的病变。在硅酸钠暴露和头部注射海藻酸钠和3-硝基丙酸的基础上，对斑马鱼成鱼的黑暗处理可以进一步加速诱导阿尔茨海默症的进程。
17、喂食碘乙酸钠能够导致斑马鱼成鱼的代谢紊乱，进而导致淀粉样蛋白沉积，神经纤维异常缠结，胆碱能神经和g蛋白信号级联损伤，诱发神经毒性，尤其是影响神经退行性病变的发生和进展。紫外光可在一定程度上诱导大脑炎症病变，升高血清中的糜蛋白酶，沉积炎性细胞因子，会有助于淀粉样蛋白沉积和组织的破坏。喂食碘乙酸钠和紫外光照射可共同诱导斑马鱼成鱼的神经退行性病变和神经细胞凋亡，从而有助于诱导斑马鱼成鱼的阿尔茨海默症。在硅酸钠暴露、头部注射海藻酸钠和3-硝基丙酸、和黑暗处理的基础上，喂食碘乙酸钠和紫外光照射可进一步保证斑马鱼成鱼阿尔茨海默症的诱导发生。
18、4、本研究可为深入解析人类患阿尔茨海默症后的脑部免疫机制以及评价治疗新方法提供良好的理论支撑和模型参考。研究团队对该模型进行了多次重复验证，结果可靠，并已利用该模型对多种药物进行了药效评价，验证了模型的应用价值。该动物模型表现出阿尔茨海默症的典型特征：胆碱能神经元丢失、脑区病理斑块增加、神经细胞内神经原纤维缠结、记忆力减退等。该模型可用于阿尔茨海默症相关领域的基础研究，为探索阿尔茨海默症的致病机理奠定实验动物基础。本研究可为阿尔茨海默症药物药效的评价提供可靠的动物模型，其具有造模周期短、稳定性和重复性较好、更加贴近临床等优点。