一种生物杀虫剂、制备方法及用途与流程

本发明属于植物保护相关领域，涉及一种生物杀虫剂制备方法及用途。

背景技术：

1、虽然化学农药是植物保护的主力军，但其大部分对环境和健康有害。例如，氨基甲酸酯类杀虫剂因其严重的毒性在2010年前后分别在欧洲和美国被禁用。农业生产中屡见不鲜因农药毒性导致健康和生态破坏，残留在食品中的农药影响使用者的健康，而肥沃的农田也遭到不可逆转的毒害。因此，希望采用无毒的生物制品作为农药，替代化学农药，提高作物的食用健康特性和降低其对环境生态的影响。

2、以植物油脂为原料可生产得到碳链长度16-20的游离混合长链脂肪酸。该脂肪酸的钾盐在美国已被登记作为杀虫剂(商品名为m-pede)，适用于控制包括蚜虫(aphididae)、毛毛虫(lepidoptera)、花边虫(tingidae)、蜘蛛螨(tetranychidae)和白粉虱(aleyrodoidea)等。其优势是触杀型，杀虫速度快，且无农药残留问题，可当天采收。但是，该产品存在杀虫效率低和价格高的致命缺陷。m-pede产品含49％的脂肪酸钾，使用时需要稀释40-100倍，杀虫作用浓度高达4.9-12g/l。另外，该产品由于是碳链长度18-22的长链脂肪酸组成，水溶性差，需要通过复杂的制剂工艺使其在水中形成稳定状态，可能因此而造成其价格高(每加仑$153.00，折合每公斤人民币286元)。另一产品是safer杀虫皂，同样使用浓度和价格都很高。如此高的使用量及价格只能在高端的家庭农场使用，不适合我国国情，更不适合于大宗产品如水稻、玉米和小麦等农业生产活动。

3、众所周知，微生物代谢产品是一类以微生物工业发酵制备得到的产品。这些产品不仅促植物生长，还可防治病虫害。微生物工业发酵可持续地、低成本和大批量地生产微生物代谢产品，利用此代谢产品作为生物杀虫剂，可显著提高农业植物保护效率和降低农业生产成本。可是，利用微生物代谢产品防治植物害虫，还有许多工作要做。

4、中链羟基脂肪酸是南非切叶蚁的腺体分泌物，据猜测以3-羟基癸酸为主的中链羟基癸酸可保障切叶蚁在阴暗潮湿的地下5-7米蚁窝从事农业活动，即种植唯一农产品--白环姑，供给蚁后和幼蚁食用。同时，蜂王浆也含有中链羟基脂肪酸(如羟基癸烯酸、10-羟基癸酸和3-羟基癸酸)，据研究可消除炎症和增加抵抗力，有益于人体健康。由于具其特征性的碳链长度c8-c14和活泼羟基基团，中链羟基脂肪酸与生物细胞膜的相互作用要远强于长链脂肪酸对昆虫表面的作用。

5、中链羟基脂肪酸属于微生物代谢物，可通过工业发酵进行大量制备。科学家已尝试通过基因重组法制备中链羟基脂肪酸，但产量偏低或分离方法过于复杂，例如清华大学陈国强教授等人采用重组大肠杆菌培养120-600mg/l的3-羟基癸酸(中国发明专利，cn137911)，而采用工程菌株pao1(δrhlbc)进行发酵培养虽然可产生13g/l的3-羟基癸酸，但因采用植物油脂作为的碳源，导致其分离提取步骤极其复杂(中国发明专利，cn108587989)。

6、目前，尚未见含中链羟基脂肪酸作为杀虫剂的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种含中链羟基脂肪酸的生物杀虫剂、其生物发酵制备方法和用途。

2、本发明第一个方面，提供了一种生物杀虫剂，所述生物杀虫剂包括中链羟基脂肪酸，所述中链羟基脂肪酸是指碳链长度8-14的羟基脂肪酸。

3、进一步地，所述中链羟基脂肪酸是3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、3-羟基月桂酸、3-羟基棕榈酸的混合物。

4、进一步地，所述中链羟基脂肪酸包含3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、3-羟基月桂酸和3-羟基棕榈酸，其中，3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、3-羟基月桂酸、3-羟基棕榈酸的质量比为：2～7:10～20:6～8:2～5。

5、进一步地，所述生物杀虫剂的剂型为水溶液，所述中链羟基脂肪酸的总质量百分含量为20％-40％。

6、本发明的第二个方面，提供了一种生物杀虫剂的制备方法，考虑到以植物油脂为碳源的中链羟基脂肪酸发酵成本较高，且其产率比较低和产品分离难度大，这是中链羟基脂肪酸还未实现大规模化生产的主要原因。近年来豆油价格逐年上升，最近价格最高可达1-1.3万元/吨。菌体生长阶段可用葡萄糖代替油脂，且以植物油为碳源时，发酵液中会存在残留大量油脂以及产生的脂肪酸，增加了后续分离提纯难度。因此本发明将亲水碳源与疏水碳源进行复合，作为发酵底物，以提高发酵效率和减少杂质生成。

7、具体地，将假单胞菌菌种接种到发酵培养基进行发酵，至发酵12小时后流加亲水性碳源和疏水性碳源，使亲水性碳源浓度维持在0.5-2g/l和疏水性碳源浓度维持在3-6g/l,至发酵结束前至少5小时停止流加豆油；发酵结束后收集发酵液分离提纯获得所述生物杀虫剂。

8、进一步地，初始发酵培养基组成如下：疏水性碳源，10g/l；葡萄糖，40g/l；kno3，8g/l；nacl，1.5g/l；kcl，1.5g/l；cacl2·2h2o，0.2g/l；kh2po4，4g/l；na2hpo4·12h2o，4g/l；mgso4，0.3g/l；fecl3，80mg/l，znso4，0.75mg/l；cuso4，0.35mg/l；mnso4，0.35mg/l。其中，疏水性碳源不局限于大豆油，菜籽油、花生油和米糠油皆可代替大豆油。亲水性碳源为葡萄糖等。

9、进一步地，分离提纯具体为：

10、在发酵液中加酸调节ph至3-4沉淀，得到沉降絮体；

11、在沉降物絮体中加碱水解，再经固液分离，收集液体得到所述生物杀虫剂。

12、进一步地，碱包括氢氧化钠或氢氧化钾，固液分离方法包括抽滤、板框分离和膜分离。

13、本发明方法采用亲水性碳源-葡萄糖作为辅助碳源和疏水性碳源-植物油脂为主碳源进行发酵，可以降低生产成本，并显著减少发酵过程中产生的杂质。在复合碳源存在下，假单胞菌(如恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌等)先利用葡萄糖进行快速增殖，待菌体在发酵12小时后达到生长平衡，则降低葡萄糖流加量和增加植物油脂加量，使葡萄糖浓度维持在0.5-2g/l,维持菌体的基础代谢，而植物油脂流加则使其浓度稳定在3-6g/l，至发酵停止前5小时停止流加植物油脂。整个发酵阶段的碳源组成控制可加速菌体的初期生长和中后期的产量表达，可显著提高油脂转化率和中链羟基脂肪酸的表达水平，极大地降低发酵终止液中的杂质含量，从而大幅度降低发酵成本。由于发酵液中中链羟基脂肪酸容易聚合形成二聚体或三聚体，因此发酵液需经过水解和分离步骤得到富含自由中链羟基脂肪酸的产品。其中，发酵液经酸化沉降能去除葡萄糖及其它水溶性杂质，而得到的沉降物富含中链羟基脂肪酸、长链脂肪酸、油脂以及菌体，该沉降物经碱水解处理(90-120℃半小时)及后续的固液分离后，可得到中链羟基脂肪酸混合溶液，而菌体和少量的长链脂肪酸则成为固渣被去除。中链羟基脂肪酸的组成与含量则采用甲酯化后气相色谱法分析。

14、本发明的第三方面，提供了一种所述的生物杀虫剂的用途，用于防治青虫、菜青虫、水稻二化螟、飞虱、蓟马和豆荚冥等虫害。

15、进一步地，所述的生物杀虫剂中含中链羟基脂肪酸的浓度为300mg/l～5000mg/l。

16、在开发该产品的应用研究中，我们惊讶地发现中链羟基脂肪酸可以快速且高效杀灭各发育阶段的青虫(包括螟虫等)，尤其是幼虫以及蛾子等。目前，尚未见含中链羟基脂肪酸作为杀虫剂的报道。该产品的开发应用对农业绿色生产和实现农药化肥“双减”具有重要的意义。

17、本发明通过多个实施试验在浙江省露天或大棚的有机农场内进行，其中蔬菜和水稻作为试验作物，每亩按照下表2所列出的用量施用，使用杀虫剂组合物喷雾处理植株1-2次。每个试验设置4个重复小区，随机区组排列，每个小区面积约为15-300m2，采用定点定株调查方法，每个小区调查5点，每点调查5株，施药前调查虫口基数，施药后5分钟和3天调查虫口存活数。

18、田间防效试验，药效计算方法如下：

19、杀虫率(％)＝(处理前虫口数量或密度-给药组虫口数量或密度)/处理前虫口数量或密度×100％。

20、本发明的有益效果是：自然界中，中链羟基脂肪酸主要来源于微生物发酵产物或昆虫分泌物(如蜜蜂分泌的蜂王浆中含有羟基癸烯酸和南非切叶蚁的腺体分泌物)，对环境也十分友好。中链羟基脂肪酸也是化妆品/洗发香波中经常使用的皮肤调理剂、无毒、残留少，对人体的安全性极高，且尤其适合于无人机操作，保护作物免于虫害的同时避免破坏环境。其推广与应用将对生态环境保护、农民增收起到重要作用。对于实现其产业化批量生产，用于科学研究和农业生产上具有重要的现实意义。中链羟基脂肪酸可以快速且高效杀灭各发育阶段的青虫(包括螟虫等)，尤其是卵、幼虫以及蛾子等。另外，中链羟基脂肪酸具有腐殖酸、γ-氨基丁酸和褐藻寡糖类似的促植物生长的功效。

21、综上，本发明提供了一种可以作为杀虫剂的中链羟基脂肪酸。本发明发现中链羟基脂肪酸对多种昆虫具有优异的杀虫作用，尤其是针对大田作物常见的害虫(包括稻飞虱、水稻卷叶螟、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾等)等，杀虫率高达90％以上。此外，本发明杀虫剂主成分来源于微生物发酵产品，属于绿色环保植物源农药的范畴，易降解，绿色环保，对人畜、环境安全。本发明制备方法简单，易于操作，效率高，适合工业化生产，可以作为一种具有作用快速、杀虫效果优、高经济效益和有效成分多元化的新型生物农药进行开发。