一种用于成体胰岛干细胞和胰岛类器官的冻存方法及冻存液与流程

本发明涉及一种干细胞或类器官的保存方法。本发明还涉及用于上述方法的冻存液。

背景技术：

1、胰岛移植重建生理性血糖调节系统，是一种成熟的、治疗晚期糖尿病的临床手段。但是局限于胰腺器官的保存时间短(器官获取后需放在0-4度的器官保存液中，冷缺血时间不能超过12小时)，并且胰岛在体外无法长期培养(获取后到移植期间不超过72小时)，导致胰腺获取难度大、胰岛纯化得率的不稳定。加上目前尚无能达到医疗使用级别的胰岛冻存的方法，进一步阻碍了胰岛移植临床治疗的普及。

2、现有的冻存方法都旨在保护胰岛细胞亚群的活率与功能：通过调整不同冷冻保护介质(cryopreservation agents,cpa)在冻存液中的比例，以及缩短冻存和复苏操作时长来维持细胞内外的等渗比，提高复苏后胰岛细胞的活率。然而，胰岛细胞对于渗透压的变化极其敏感，实验室的研究数据显示，为了保护胰岛细胞的细胞壁在冻存过程中不因冰晶结构的形成而被破坏，需要高达44％的cpa比例。由于cpa本身对细胞有毒性，如此高比例的cpa不能用于临床(常规的免疫细胞治疗中cpa的占比为小于等于10％)。此外，研究发现，对于小批量胰岛(约150-1500ieq(islet equavalent unit,标准胰岛单位))的冻存和复苏，使用激光迅速加热的方法，可以有效维持复苏后胰岛的功能。但是，临床移植的胰岛量需要达到5000-10000ieq/kg体重，因此目前也无法应用到临床治疗的场景中。

3、虽然胰岛移植可以补充重症病人体内的胰岛功能细胞数量，帮助维持血糖稳态。但由于供体器官来源的局限，研究者们一直在积极寻求其他细胞来源，例如在体外培养产生具有胰岛素分泌能力的类β细胞。从成体胰岛干细胞构建的胰岛类器官有望弥补胰岛供体不足的缺陷。类器官是一种细胞自我组织(self-organization)形成的三维组装体，其能够表现出细胞所属器官的生理特征，并且细胞成分和结构也与所属器官相似。成体干细胞具有自我更新(self-renewal)、分化可控的优势，因而成为构建类器官系统的基础。成体胰岛干细胞构建的胰岛类器官，能够提供体细胞来源的、可扩增、可长期培养的胰岛样细胞，不仅能为探究胰岛发育、糖尿病发病机制和治疗策略提供体外模型，也将为未来糖尿病的细胞治疗提供新的细胞来源。

4、胰岛类器官具有与胰岛相似的细胞特性，因此，常规的类器官冻存方法(10％cpa+10％血清蛋白)并不适用于胰岛类器官的冻存。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供一种用于成体胰岛干细胞和胰岛类器官的冻存方法。

2、本发明的第二个目的是提供一种用于上述方法的冻存液。

3、根据本发明的一方面，适用于成体胰岛干细胞和胰岛类器官的冻存方法，包括下述步骤：

4、1)从目标组织中解离细胞，其中所述目标组织选自供体的胰岛干细胞和胰岛类器官；

5、2)将步骤1)解离的细胞用冻存液1处理，获得用于冻存的胰岛干细胞或胰岛类器官；

6、3)将步骤2)获得胰岛的干细胞或胰岛类器官冻存；

7、其中步骤2)所述冻存液1包含：

8、5～20％体积(v/v)人血清白蛋白或胎牛血清、0.5～2m二甲亚砜、50～250mm氯化胆碱、0.01～2mm钙盐、10～100μm钾盐、0.01～1mm镁盐、1～20μm葡萄糖，用细胞培养基补足到所需体积，调节ph7.0～7.4。

9、在上述冻存液的组成中，优选的钙盐为氯化钙，优选的镁盐为氯化镁或磷酸镁，优选的钾盐是钾盐混合物，所述钾盐混合物包括10～100μm氯化钾、10～100μm磷酸二氢钾和10～100μm磷酸氢二钾。

10、所述细胞培养基可以是任何常用的细胞培养基，优选的是用imdm和f12 1:1等体积混合配制的培养基，较佳的冻存液中培养基占比为60％体积(v/v)。

11、在本发明的一个实施方案中，优选的冻存液1包含：

12、10％体积(v/v)胎牛血清或15％体积(v/v)人血白蛋白；2m二甲亚砜；

13、200mm氯化胆碱；0.8mm钙盐(cacl2.2h2o)；100μm钾盐混合物(包含26.8μmkcl、14.7μm kh2po4和65.4μm k2hpo4.3h2o)；0.4mm镁盐(mgcl2.6h2o)；10μm葡萄糖；并用培养基(imdm和f12 1:1等体积混合配制)定容后，将ph调节至7.0～7.4之间。

14、在本发明的一个实施方案中，所述步骤2)中优选地进行二步冻存，在冻存中，所述冻存液可以是二组冻存液，冻存液1为包含上述组分的冻存液，冻存液2在上述冻存液1中进一步包含0.2～2m乙二醇。

15、优选的冻存液2包括：10％体积(v/v)胎牛血清或15％体积(v/v)人血白蛋白；1m二甲亚砜；1m乙二醇；200mm氯化胆碱；0.8mm钙盐(具体为cacl2.2h2o)；100μm钾盐混合物(包含26.8μm kcl、14.7μm kh2po4和65.4μmk2hpo4.3h2o)；0.4mm镁盐(具体为mgcl2.6h2o)；10μm葡萄糖；并用培养基(imdm和f12 1:1等体积混合配制)定容后，将ph调节至7.0～7.4之间。

16、可选地，本发明所述的方法进一步包括对冻存的细胞或类器官进行复苏后质量评价的步骤。

17、在本发明的一个优选实施方式中，所述步骤1)包括：

18、1a)供体的胰岛干细胞：将获取供体的胰岛干细胞进行染色以确定其纯度大于70％。用包含人血白蛋白的洗液进行洗涤并沉淀，获得胰岛干细胞；或者

19、胰岛类器官：收集胰岛类器官，弃去培养基，用包含人血白蛋白的洗液进行洗涤后离心沉淀组织，获得胰岛类器官；

20、1b)将步骤1a)获得的胰岛干细胞/类器官充分重悬在解离液中，洗涤并沉淀细胞和/或组织；

21、更优选的是，所述步骤1a)的包含人血白蛋白的洗液中含有优选浓度为5～20％体积(v/v)的人血清白蛋白。

22、所述步骤1b)中，每0.5ml组织沉淀用3ml解离液，解离液可以是商业化的accutase,trypsin,tryple select消化液中的一种。将重悬后的组织放进37度培养箱，孵育5-8分钟后取出，用移液枪吹打至散开。在显微镜下观察，确保80％以上的组织都分散成小于10个细胞的细胞团后，用洗液重悬至15ml,然后离心沉淀组织(离心机设置为离心速度1100rpm,离心时间3min，离心温度4度)，弃去上清后，重复步骤洗涤细胞一次。

23、在本发明的一个优选实施方式中，所述步骤2)使用二步冻存法，将步骤1)获得的解离的细胞和/或组织分别用冻存液1和冻存液2进行孵育，具体包括：

24、2a)用冻存液1重悬步骤1)解离后的细胞和/或组织沉淀，轻吹均匀后，放在2～8度孵育，优选孵育时间为10～45分钟；

25、2b)用预冷好的冻存液2再次重悬组织沉淀，轻吹均匀后，放在2～8度孵育，优选孵育时间为10～45分钟；

26、将孵育完成的悬液轻吹均匀后，分装至2～8度预冷的冻存管内，并转移至梯度冻存盒。以-1℃/分钟的速率降温至-80度，保存24～48小时，然后转移至液氮进行低温长期保存。

27、在本发明的一个优选实施方式中，所述复苏后的质量评价包括下述方面的评价：

28、a)复苏后成体胰岛干细胞的得率：利用流式分析的方法，对比复苏后的胰岛与新鲜胰岛中的胰岛干细胞的比例。

29、b)复苏后胰岛类器官的活率和扩增：评价复苏后胰岛干细胞的扩增能力。

30、c)复苏后成体胰岛干细胞的类器官构建：利用流式分离的方法，对比复苏后的胰岛与新鲜胰岛干细胞形成胰岛类器官的能力。

31、根据本发明的另一方面，提供一种用于本发明方法的冻存液，所述冻存液包含：5～20％体积(v/v)人血清白蛋白或胎牛血清、0.5～2m二甲亚砜、50～250mm氯化胆碱、0.01～2mm钙盐、10～100μm钾盐、0.01～1mm镁盐、1～20μm葡萄糖，用细胞培养基补足到所需体积，调节ph7.0～7.4。

32、优选地，所述冻存液包含二组冻存液，冻存液1和冻存液2，所述冻存液2为在冻存液1中进一步含有0.2～2m乙二醇。

33、在本发明的一个实施方案中，优选的冻存液1包含：

34、10％体积(v/v)胎牛血清或15％体积(v/v)人血白蛋白；2m二甲亚砜；200mm氯化胆碱；0.8mm钙盐(cacl2.2h2o)；100μm钾盐混合物(包含26.8μmkcl、14.7μm kh2po4和65.4μmk2hpo4.3h2o)；0.4mm镁盐(mgcl2.6h2o)；10μm葡萄糖；并用培养基(imdm和f12 1:1等体积混合配制)定容后，将ph调节至7.0～7.4之间。

35、优选的冻存液2包含：10％体积(v/v)胎牛血清或15％体积(v/v)人血白蛋白；1m二甲亚砜；1m乙二醇；200mm氯化胆碱；0.8mm钙盐(cacl2.2h2o)；100μm钾盐混合物(包含26.8μmkcl、14.7μm kh2po4和65.4μm k2hpo4.3h2o)；0.4mm镁盐(mgcl2.6h2o)；10μm葡萄糖；并用培养基(imdm和f12 1:1等体积混合配制)定容后，将ph调节至7.0～7.4之间。

36、有益效果：

37、本发明提供了一种适用于胰岛干细胞和胰岛类器官的冻存方法和冻存液。经冻存复苏后的胰岛干细胞能够有效形成胰岛类器官，且复苏后的胰岛类器官也能维持扩增。并且此方法可以工艺放大，适用用于临床级别的细胞量的冻存。