一种无血清UCB-NK细胞冻存液及其制备和应用的制作方法

本发明属于细胞，具体涉及一种无血清ucb-nk细胞冻存液及其制备和应用。

背景技术：

1、自然杀伤细胞(natural killer cell，nk细胞)是人体天然免疫系统的效应细胞，是体内监视恶性病变细胞的主要功能细胞。nk细胞作为免疫细胞具有抵御病毒入侵及肿瘤杀伤的作用，是人体防御肿瘤的第一道防线，在过继免疫治疗恶性肿瘤中具有良好的应用前景。nk细胞有多种来源，包括外周血(pb)、脐带血(ucb)、诱导多能干细胞和胚胎干细胞。其中脐带血来源的nk细胞被视为一种潜在的“现成”产品，具有多种优势。

2、细胞冻存时将细胞置于低温环境下保存是细胞保存的主要方法之一，利用冻存技术将细胞置于低温保存装置中以使细胞暂时脱离生长状态，细胞因此进入休眠状态，并保持细胞特性。通过冷冻方式保存细胞，可以长期保存，在生产和实验中可通过复苏继续培养，节约人力和物力成本。同时，低温保存也能够避免细胞丢种，在培养中因细胞污染或其他意外因素导致的细胞品种丢失，利用细胞冻存的形式来提升细胞流通性。

3、细胞冻融过程对所有细胞和组织都是有一定伤害的，无论是快速冷冻还是慢速冷冻，均需要冷冻保护剂。冻存保护剂是可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，冻存保护剂同溶液中的水分子结合以防止冷冻冰晶对细胞造成的损伤。一般而言，冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种。渗透性冷冻保护剂一般是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内，该类保护剂主要包括如二甲基亚砜(dmso)、甘油(gly)、甲醇(meth)、乙二醇(ge)、丙二醇(pg)、乙酰胺、二乙基酰胺(dmf)和二甲基乙酰胺(dma)等。其保护机制是在冷冻时在细胞冷冻悬液完全凝固之前，保护剂渗透进入细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度起保护作用。非渗透性冷冻保护剂也称膜外保护剂一般是些大分子物质不能渗透到细胞内，该类保护剂主要包括果糖(fructose)、蔗糖(suc)、海藻糖(tre)、右旋糖酐(dextran)、卵黄(yolk)、白蛋白(albumin)等。其保护机制的假设很多，其中一种可能是，大分子物质可以优先同溶液中的水分子相结合，减少冰晶的形成。

4、传统的细胞冻存液是在无血清基础培养基中添加胎牛血清和渗透性保护剂dmso配制而成，此种冻存液需会受到不同来源产地血清的成分波动影响，具有一定安全隐患。同时作为渗透性细胞冻存保护剂的dmso，是有毒的，可能导致各种副作用。甘油作为dmso的互补或替代添加物，尽管细胞的毒性低于dmso，但是由于其是渗透性冻存保护剂，在细胞复苏后仍会影响细胞活性。因此，在选择细胞冻存保护剂时，尽可能的选择非渗透性保护剂组合是一种有效且安全的研究方案。

5、目前，随着细胞培养技术的不断更新，无血清培养技术已是一种普遍应用，无血清且化学成分明确的冻存液逐渐到受研发人员的青睐。因此，探索一nk细胞纯度、数量、产品稳定性、安全性、工艺可操作性俱佳的nk细胞无血清冻存液仍是人们面临的挑战。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种无血清ucb-nk细胞冻存液，通过将特定的非渗透性冷冻保护剂与细胞因子复配，实现极端条件下保护细胞免受伤害，且维持细胞原有杀伤活力的作用。

2、本发明提供了一种无血清nk细胞冻存液，为包括冷冻保护剂、细胞因子的无血清基础培养基；

3、所述冷冻保护剂包括羧基化多聚赖氨酸、右旋糖苷40和四氢甲基嘧啶羧酸；

4、所述细胞因子包括重组人白介素-2和重组人白介素-15；

5、所述羧基化多聚赖氨酸的体积分数为1％～10％，所述右旋糖苷40的质量分数为1％～10％；所述四氢甲基嘧啶羧酸的质量分数为1％～10％；所述重组人白介素-2的含量为200～2000u/ml，重组人白介素-15的含量为10～50ng/ml。

6、优选的，所述羧基化多聚赖氨酸的体积分数为7.5％，所述右旋糖苷40的质量分数为5％，所述四氢甲基嘧啶羧酸的质量分数为5％；所述重组人白介素-2的含量为1000u/ml；所述重组人白介素-15添加量为25ng/ml。

7、优选的，所述羧基化多聚赖氨酸的制备方法，是ε-多聚赖氨酸和琥珀酸酐在48～52℃反应50～70min后获得。

8、优选的，所述ε-多聚赖氨酸和琥珀酸酐的质量比为1：(0.5～1)。

9、优选的，所述无血清基础培养基包括therapeaktmx-vivo 15培养基、ctstmaimvtmsfm(ruo)培养基或kbm 581培养基。

10、本发明提供了所述无血清nk细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：

11、向无血清基础培养基中逐步加入羧基化多聚赖氨酸溶液，然后加入右旋糖苷40、四氢甲基嘧啶羧酸、重组人白介素-2和重组人白介素-15混匀，用无血清基础培养基定容即可。

12、本发明提供了所述无血清nk细胞冻存液在nk细胞冻存中的应用。

13、优选的，所述nk细胞包括以下至少一种：脐带血来源的nk细胞、外周血来源的nk细胞和干细胞分化的nk细胞。

14、本发明提供了一种nk细胞的冻存方法，包括以下步骤：

15、将nk细胞转移至冻存管中，加入所述无血清nk细胞冻存液至细胞浓度为(1～10)×107/ml，冷冻处理。

16、优选的，所述冷冻处理的方法为将细胞冻存管放置于梯度降温盒中在-80℃温度条件下保存10～14h后，在转移至液氮中长期保存。。

17、本发明提供了一种无血清nk细胞冻存液，为包括冷冻保护剂、细胞因子的无血清基础培养基；所述冷冻保护剂包括羧基化多聚赖氨酸、右旋糖苷40和四氢甲基嘧啶羧酸；所述细胞因子包括重组人白介素-2和重组人白介素-15；所述羧基化多聚赖氨酸的体积分数为1％～10％，所述右旋糖苷40的质量分数为1％～10％；所述四氢甲基嘧啶羧酸的质量分数为1％～10％；所述重组人白介素-2的含量为200～2000u/ml，重组人白介素-15的含量为10～50ng/ml。本发明选用非渗透性保护剂组合羧基化多聚赖氨酸、右旋糖苷40和四氢甲基嘧啶羧酸替代了有毒性的二甲基亚砜作为冷冻保护剂，同时添加的细胞因子有效保护nk细胞在冻存条件下的活性，并保持了细胞复苏后的细胞毒性功能；采用无血清培养液替代常规平衡缓冲液为冻存nk细胞提供营养和生长所需的基本成分，无需添加胎牛血清，降低了各类细菌、病毒和支原体等污染风险，保证冻存细胞的安全。可见本发明提供的冻存液成分明确简单，不含血清，dmso成分，具有成分稳定、安全，配置完成后可直接使用无需预冷可直接使用。实施例结果表明，本发明提供的冻存液具有冻存后细胞活率和活性均高，优于传统细胞冻存液的冻存效果。

技术特征：

1.一种无血清nk细胞冻存液，其特征在于，为包括冷冻保护剂、细胞因子的无血清基础培养基；

2.根据权利要求1所述无血清nk细胞冻存液，其特征在于，所述羧基化多聚赖氨酸的体积分数为7.5％，所述右旋糖苷40的质量分数为5％，所述四氢甲基嘧啶羧酸的质量分数为5％；所述重组人白介素-2的含量为1000u/ml；所述重组人白介素-15添加量为25ng/ml。

3.根据权利要求1所述无血清nk细胞冻存液，其特征在于，所述羧基化多聚赖氨酸的制备方法，是ε-多聚赖氨酸和琥珀酸酐在48～52℃反应50～70min后获得。

4.根据权利要求1所述无血清nk细胞冻存液，其特征在于，所述ε-多聚赖氨酸和琥珀酸酐的质量比为1：(0.5～1)。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述无血清nk细胞冻存液，其特征在于，所述无血清基础培养基包括therapeaktmx-vivo 15培养基、ctstmaim vtmsfm(ruo)培养基或kbm 581培养基。

6.权利要求1～5中任意一项所述无血清nk细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.权利要求1～5中任意一项所述无血清nk细胞冻存液在nk细胞冻存中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述nk细胞包括以下至少一种：脐带血来源的nk细胞、外周血来源的nk细胞和干细胞分化的nk细胞。

9.一种nk细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述nk细胞的冻存方法，其特征在于，所述冷冻处理的方法为将细胞冻存管放置于梯度降温盒中在-80℃温度条件下保存10～14h后，在转移至液氮中长期保存。

技术总结
本发明提供了一种无血清UCB‑NK细胞冻存液及其制备和应用，属于细胞技术领域。一种无血清NK细胞冻存液，含体积分数为1％～10％羧基化多聚赖氨酸、质量分数为1％～10％右旋糖苷40、质量分数为1％～10％四氢甲基嘧啶羧酸、200～2000U/ml重组人白介素‑2、10～50ng/ml重组人白介素‑15的无血清基础培养基。本发明冻存液成分明确简单，不含血清和DMSO成分，具有成分稳定、安全，配置完成后可直接使用无需预冷可直接使用。实验结果表明，本发明提供的冻存液具有冻存后细胞活率和活性均高，优于传统细胞冻存液的冻存效果。

技术研发人员：杨兆勇,孙正阳,金媛媛,邹森,樊帅,陈浩东,吴春涛
受保护的技术使用者：山东金砖生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17