一种锐尖山香圆优良无性系的组培快繁方法与应用

本发明涉及植物组织培养，具体公开一种锐尖山香圆优良无性系的组培快繁方法与应用。

背景技术：

1、锐尖山香圆为省沽油落科山香圆属，常绿灌木或小乔木，生于沟谷林缘或灌丛中，分布于江西省、湖南省、福建省等地，为国家中药保护品种，用于治疗咽喉炎、扁桃体炎、扁桃体脓肿、上呼吸道感染、气管炎等疾病，具有速效高效等特点。一般采用传统的播种方法进行繁殖，但种子繁殖后其后代性状发生分离，无法保持母本植株的优良性状。而采用组织培养方法进行锐尖山香圆的繁殖，可保持母本优良性状，为优良单株的快速扩繁提供途径。

2、现有技术公开了一种山香圆再生植株的快速繁殖方法，包括山香圆叶片的消毒、愈伤组织的诱导、愈伤组织的分化、生根诱导、炼苗移栽，主要步骤如下：取山香圆幼嫩的叶片，进行消毒处理；选取山香圆幼嫩的叶片，流水冲洗干净，用1％次氯酸钠中浸泡8min，浸入70％酒精1min，无菌水冲洗5遍至无残留，消毒处理过的山香圆叶片接入培养基msb+1.0mg/l 6-ba+0.02mg/lnaa中进行愈伤组织的诱导，附加蔗糖30g/l，琼脂7g/l，温度24℃，暗光照，ph 5.8，诱导出来的愈伤组织放入培养基msb+1.0-1.2g/l 6-ba+0.8-1.0mg/lkt+硫酸腺嘌呤10-20mg/l进行愈伤组织的分化，附加蔗糖30g/l，琼脂7g/l，温度24℃，光照强度25001x，每天光照时间10h，ph 5.8，分化培养出来的不定芽放入ms培养基中生根诱导，生根后的试管苗进行炼苗移栽；炼苗方法为已生根的幼苗，洗去琼脂，移栽到装有石：泥炭＝1：1的育苗箱内，覆盖塑料薄膜，一周后揭膜，在玻璃温室中生长。

3、上述技术采用组织培养中的器官间接发生途径，由外植体经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官，获得再生植株。但该途径仍然存在一定的缺陷，即愈伤组织的细胞在遗传上具有不稳定性，使得母本的优良性状不能得以保持，且随着愈伤组织继代培养时间的延长，它们最初所表现的植株再生能力会逐渐下降，甚至完全消失。因此，开发一种可保持母本优良性状、诱导率高、增殖倍数高、生根率高以及培育时间短的锐尖山香圆优良无性系的组培快繁方法，对于促进锐尖山香圆开发利用具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种可保持母本优良性状、诱导率高、增殖倍数高、生根率高以及培育时间短的锐尖山香圆优良无性系的组培快繁方法。

2、第一方面，本发明提供一种锐尖山香圆优良无性系的组培快繁方法，包括如下步骤：

3、(1)外植体的选取与消毒：选取锐尖山香圆的单芽茎段作为外植体，先用70-75％酒精消毒，无菌水一次清洗后，再用添加有表面活性剂的0.1-0.2％升汞水溶液消毒，无菌水二次清洗，备用；

4、(2)初代培养：将消毒后的外植体置于初代培养基中进行诱导培养，诱导分化出不定芽；

5、所述初代培养基的组成包括：ms培养基、20-30g/l的蔗糖和5-7g/l的琼脂；

6、(3)继代培养：将所述不定芽置于继代培养基中进行增殖培养，得到继代苗；

7、所述继代培养基的组成包括：ms培养基、0.5-1mg/l的6-苄氨基腺嘌呤、0.02-0.06mg/l的萘乙酸、0.5-1mg/l的赤霉素、20-30g/l的蔗糖和5-7g/l的琼脂；

8、(4)生根培养：将所述继代苗置于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗；

9、所述生根培养基的组成包括：改良ms培养基、0.5-1mg/l的吲哚丁酸和0.5-1mg/l的萘乙酸，20-30g/l的蔗糖和5-7g/l的琼脂；所述改良ms培养基是将ms培养基中的大量元素含量减半，铁盐、微量元素、有机物以及肌醇含量保持不变；

10、(5)移栽驯化：将所述生根苗移栽到基质中，控制湿度和光照进行炼苗；

11、其中，步骤(2)和步骤(3)中的培养条件均包括：温度24±2℃，光照强度2000-2500lux，光周期为白天/黑暗＝14h/10h，生长周期4-5周；

12、步骤(4)中的培养条件包括：温度22±3℃，光照强度2000-2500lux，光周期为白天/黑暗＝14h/10h，生长周期4-5周。

13、在一种可选的实施方式中，所述初代培养基、所述继代培养基和所述生根培养基的ph值均为5.8-6.0。

14、在一种可选的实施方式中，所述初代培养基、所述继代培养基和所述生根培养基在使用前都进行了灭菌处理，灭菌条件包括：温度121-126℃，灭菌时间18-20min。

15、在一种可选的实施方式中，所述ms培养基的组成包括大量元素、铁盐、微量元素和有机物，所述大量元素包括硝酸铵1650mg/l、硝酸钾1900mg/l、七水硫酸镁370mg/l、磷酸二氢钾170mg/l和二水氯化钙440mg/l，所述铁盐包括七水硫酸亚铁27.8mg/l和乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l，所述微量元素包括一水硫酸锰16.9mg/l、七水硫酸锌8.6mg/l、硼酸6.2mg/l、碘化钾0.83mg/l、五水硫酸铜0.025mg/l、六水氯化钴0.025mg/l和二水钼酸钠0.25mg/l，所述有机物包括甘氨酸2mg/l、吡哆醇0.5mg/l、烟酸0.5mg/l、硫胺素0.1mg/l和肌醇100mg/l。

16、在一种可选的实施方式中，所述继代培养的增殖系数为2-3。

17、在一种可选的实施方式中，所述不定芽的长度为1.5-2cm。

18、在一种可选的实施方式中，所述继代苗的高度为2-2.5cm。

19、在一种可选的实施方式中，所述炼苗步骤包括：当生根苗的新根系长至1cm后，移到自然光照3000-4000lux和湿度50-90％进行炼苗1周。

20、在一种可选的实施方式中，所述基质包括质量比为3-7：1的蛭石和泥炭土的混合物。

21、在一种可选的实施方式中，所述表面活性剂与所述升汞水溶液的质量比为1：490-510。

22、在一种可选的实施方式中，所述表面活性剂为吐温20、吐温80中的至少一种。

23、在一种可选的实施方式中，所述一次清洗数次为2-4次。

24、在一种可选的实施方式中，所述二次清洗数次为5-7次。

25、第二方面，本发明提供一种上述锐尖山香圆优良无性系的组培快繁方法在锐尖山香圆工业化生产中的用途。

26、在组织培养实验中，一般细胞分裂素与生长素配合使用，不同的添加比例往往会导致不同的培养效果，如生长素/细胞分裂素高，有利于根分化，生长素/细胞分裂素低，有利于芽分化。

27、与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点：

28、1、本发明提供锐尖山香圆优良无性系的组培快繁方法，包括如下步骤：(1)外植体的选取与消毒：选取锐尖山香圆的单芽茎段作为外植体，先用70-75％酒精消毒，无菌水一次清洗后，再用添加有表面活性剂的0.1-0.2％升汞水溶液消毒，无菌水二次清洗，备用；(2)初代培养：将消毒后的外植体置于初代培养基中进行诱导培养，诱导分化出不定芽；(3)继代培养：将所述不定芽置于继代培养基中进行增殖培养，得到继代苗；(4)生根培养：将所述继代苗置于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗；(5)移栽驯化：将所述生根苗移栽到基质中，控制湿度和光照进行炼苗；其中，步骤(2)和步骤(3)中的培养条件均包括：温度24±2℃，光照强度2000-2500lux，光周期为白天/黑暗＝14h/10h，生长周期4-5周；步骤(4)中的培养条件包括：温度22±3℃，光照强度2000-2500lux，光周期为白天/黑暗＝14h/10h，生长周期4-5周。本发明将具有初生分化能力的外植体直接分化成器官的过程，获得再生植株，即从单芽茎段上诱导出不定芽，不形成愈伤组织。在器官直接发生途径过程中，由于细胞染色体的倍数基本保持稳定，因此发生变异的现象频率较低，可以保证锐尖山香圆苗保持母株良好的种性。

29、外植体经消毒后能够被彻底清洗干净，建立无菌体系，在初代培养中，ms培养基中不加任何植物激素，更好地模拟细胞在自然环境中的生长环境，有助于维持组织原始特性和功能；同时，减少实验变量，简化培养过程，提高实验的重复性；在继代培养中，加入高浓度的细胞分裂素(6-ba、ga3)和低浓度的生长素(naa)，有利于芽分化，提高增殖系数，产生大量植株，使植物快速繁殖为新的个体。生根培养中，使用改良ms培养基(大量元素减半，其他保持不变)，降低无机盐浓度，低无机盐就需要更发达的根系吸收，因此会诱导根发育，改良ms培养基更适合根系的生长环境，提高加入高浓度的生长素(naa、iba)，有利于植株根系分化，提高生根率；在生根培养过程中，同时加入萘乙酸和吲哚丁酸，萘乙酸主要促进细胞分裂和组织扩展，而吲哚丁酸则有助于促进细胞分化和形成根毛，两者共同作用可以更好地促进植物生根过程。

30、其中，6-ba促进细胞分裂和芽的形成，促进非分化组织分化，诱导愈伤组织的形成；ga3加速细胞的生长，对细胞的分裂也有促进作用；iba促进茎枝生长，可以促进生根，尤其是不定根的生长；naa可促进茎枝生长，也可促进生根。本发明锐尖山香圆优良无性系的组织培养育苗方法具有诱导率高、增殖倍数高及生根率高的优点，可以在短时间内得到更多的锐尖山香圆优质种苗，满足大规模商业生产的需求。

31、组织培养中除了诱导愈伤组织需要黑暗条件外，一般培养都需一定的光照。光照强度、光照时间对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。本发明在初代培养和继代培养的光照强度均为2000-2500lux，光周期为白天/黑暗＝14h/10h。

32、用消毒剂升汞对接种材料进行灭菌处理时，加入表面活性剂，可以湿润外植体整个组织，促进灭菌液充分接触表面组织，达到更好的消毒效果。