一种诱导月季植物离体再生的培养基及其应用

本发明涉及植物组织培养领域，特别涉及一种诱导月季植物离体再生的培养基以及该培养基的应用。

背景技术：

1、月季植物（ rosa spp.）是一种受欢迎的观赏植物，以其多彩的花朵和香气而著称。月季植物的繁殖和再生通常涉及复杂的组织培养过程。传统的培养基在月季植物再生方面效果有限，因为这些植物对外界环境的要求较为特殊，离体再生难度较大。

2、月季植物繁殖的传统方法通常包括种子繁殖和扦插，但这些方法存在一些限制。种子繁殖通常需要较长的时间来获得成熟植株，而扦插则受到母株的可用性和生长状态的限制。因此，离体再生技术成为一种重要的月季植物繁殖方法，它可以加速新植株的生长和繁殖。

3、离体再生是通过将植物的组织或细胞在无土的培养条件下培养，以产生新的植株。然而，月季植物的离体再生在传统培养条件下通常表现出较低的成功率和较长的培养周期。这些问题部分是由于传统培养基的成分和条件不够适合月季植物的生长和再生需求。

4、为了克服这些挑战，需要开发一种新型的培养基，以更有效地诱导月季植物的离体再生。

技术实现思路

1、为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种诱导月季植物离体再生的培养基及其应用，通过诱导培养基创造一个更适合月季植物再生的培养环境，促进月季植物的离体再生。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种诱导月季植物离体再生的培养基，包括以下组分：

4、基本植物培养基：为ms培养基（murashige and skoog基础培养基），ph调整至5.7-5.8，用于提供月季植物生长所需的基础营养成分；

5、植物生长激素：由苄基腺嘌呤（bap）和吲哚丁酸（iba）组成，其中，苄基腺嘌呤（bap）：0.5-2.0 mg/l；吲哚丁酸（iba）：0.1-1.0 mg/l，用于促进植物细胞的分裂和增殖，以及根的形成和发育；

6、维生素营养物：包含维生素混合物和氨基酸混合物，维生素营养物的浓度在0.1-10 mg/l；

7、植物抗氧化剂：为多酚类化合物抗氧化剂，浓度在10-35 mg/l；

8、生长促进因子：由椰奶、蛋白水解物以及酵母提取物组成，其中，椰奶含量为10%-20% v/v，蛋白水解物含量为100-350 mg/l；酵母提取物含量为30-80 mg/l；

9、琼脂：6-8 g/l，作为固化剂；

10、抗真菌剂：1-10 mg/l。

11、作为本发明的进一步方案，每1000ml的基本植物培养基中，苄基腺嘌呤的含量为0.5-2.0mg，吲哚丁酸的含量为0.1-1.0mg，维生素营养物的含量为0.1-10mg，植物抗氧化剂的含量为10-35mg，椰奶的含量为100-200ml，蛋白水解物的含量为100-350mg，酵母提取物的含量为30-80mg，琼脂的含量为6000-8000 mg和抗真菌剂的含量为1-10mg。

12、作为本发明的进一步方案，每1000ml的基本植物培养基中，苄基腺嘌呤的含量为1.5mg，吲哚丁酸的含量为0.5mg，维生素营养物的含量为5mg，植物抗氧化剂的含量为25mg，椰奶的含量为150ml，蛋白水解物的含量为200mg，酵母提取物的含量为50mg，琼脂的含量为7000 mg和抗真菌剂的含量为5mg。

13、作为本发明的进一步方案，所述ms培养基由无机盐、微量元素、碳源、固体化剂、ph调节剂和水组成，其中：

14、无机盐，包括：

15、硝酸铵（nh4no3）：1.65 g/l；

16、硝酸钙（ca(no3)2·4h2o）：1.47 g/l；

17、磷酸二氢钾（kh2po4）：0.17 g/l；

18、硫酸镁（mgso4·7h2o）：0.37 g/l；

19、硫酸钾（k2so4）：0.33 g/l；

20、微量元素，包括：

21、铁（feso4·7h2o）：20 mg/l；

22、锰（mnso4·h2o）：0.022 mg/l；

23、锌（znso4·7h2o）：0.08 mg/l；

24、碳源，包括：

25、蔗糖（c12h22o11）：20 g/l；

26、固体化剂，包括：

27、琼脂（agar）或琼脂胶（agarose）：1.5%至2.0%；

28、ph调节剂，包括：

29、琼脂中和剂（naoh或hcl）：用以维持培养基的ph值在5.8；

30、水，包括：

31、纯净水：用于制备培养基。

32、作为本发明的进一步方案，所述ms培养基制备方法包括以下步骤：

33、步骤1.称量无机盐和微量元素：

34、按照无机盐成分的比例，将所需的无机盐和微量元素按照给定的浓度称量出来，包括：

35、硝酸铵（nh4no3）：1.65 g；

36、硝酸钙（ca(no3)2·4h2o）：1.47 g；

37、磷酸二氢钾（kh2po4）：0.17 g；

38、硫酸镁（mgso4·7h2o）：0.37 g；

39、硫酸钾（k2so4）：0.33 g；

40、铁（feso4·7h2o）：20 mg；

41、锰（mnso4·h2o）：0.022 mg；

42、锌（znso4·7h2o）：0.08 mg；

43、步骤2.溶解无机盐和微量元素：

44、在适量的纯净水中完全溶解以上称量的无机盐和微量元素的化合物，使用磁力搅拌器进行搅拌溶解以制备无机盐溶液；

45、步骤3.添加碳源：

46、将蔗糖作为碳源精确称量，向无机盐溶液中添加20 g的蔗糖，并搅拌至完全溶解，得到混合溶液；

47、步骤4.加入固体化剂：

48、选择琼脂作为固化剂，向得到的混合溶液中加入精确称量的琼脂，浓度在1.5%至2.0%之间，即对于1000 ml的培养基，加入15-20 g的琼脂；

49、步骤5.调整ph值：

50、使用ph计检测溶液的ph值，并逐渐添加氢氧化钠（naoh）溶液，以维持培养基的ph值在5.8；

51、步骤6.灭菌：

52、将调整好的培养基在高压蒸汽灭菌器中进行灭菌，在121℃下保持15-20分钟；

53、步骤7.灭菌和分装：

54、灭菌后，在无菌操作台下，将热的培养基倒入无菌的培养皿中，冷却至室温，固化成型；将固化后的培养基在2-8℃的条件下储存，避免光照，并且在使用前保持培养基的无菌状态。

55、作为本发明的进一步方案，所述植物生长激素中苄基腺嘌呤为激素a，所述吲哚丁酸为激素b，在制备过程中，在调整ph值之前，向基本植物培养基中添加1.5 mg/l的激素a和0.5 mg/l的激素b，以促进细胞分裂和再生。

56、作为本发明的进一步方案，所述植物抗氧化剂中的多酚类化合物抗氧化剂由花青素和类黄酮组成，所述花青素和类黄酮按照质量比1:1混合且形成含量为10 mg/l多酚类化合物抗氧化剂；所述植物抗氧化剂与维生素营养物在调整ph值之前加入到混合溶液中。

57、作为本发明的进一步方案，所述维生素混合物包括以下组分及浓度：

58、维生素b1（硫胺素），浓度：0.1-5.0 mg/l；

59、维生素b2（核黄素），浓度：0.05-1.0 mg/l；

60、维生素b3（烟酸），浓度：0.2-0.4 mg/l；

61、维生素b5（泛酸），浓度：0.3-0.6 mg/l；

62、维生素b6（吡哆醇），浓度：0.05-1.0 mg/l；

63、维生素b7（生物素），浓度：0.01-0.5 mg/l；

64、维生素b9（叶酸），浓度：0.1-1.0 mg/l；

65、维生素c（抗坏血酸），浓度：0.1-3 mg/l；

66、维生素e（生育酚），浓度：0.1-1.0 mg/l。

67、作为本发明的进一步方案，所述氨基酸混合物包括以下组分及浓度：

68、赖氨酸（lysine)，浓度：0.1-0.3 mg/l；

69、苏氨酸（threonine)，浓度：0.1-1.0 mg/l；

70、苯丙氨酸(phenylalanine)，浓度：0.01-0.5 mg/l；

71、色氨酸(tryptophan)，浓度：0.05-1.0 mg/l；

72、甲硫氨酸（methionine)，浓度：0.3-0.6 mg/l。

73、作为本发明的进一步方案，所述生长促进因子中还包括赤霉素（gibberellins，ga）和吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，iaa），其中，赤霉素的浓度在1至10毫克/升（mg/l）之间，吲哚乙酸的浓度在0.1至10毫克/升之间；所述赤霉素和吲哚乙酸以溶液的形式加入到ms培养基中；

74、其中，所述赤霉素和吲哚乙酸的添加方法为：

75、预制添加：将赤霉素和吲哚乙酸预先溶解在乙酸乙酯溶剂中，充分溶解并均匀混合后得到激素溶液；

76、添加混合：将预制的赤霉素和吲哚乙酸的激素溶液在涂抹固化剂之前添加到制备好的基本植物培养基中：1/2 ms培养基，摇晃培养基，以确保激素均匀分布；

77、滤器灭菌：溶解激素溶液后，通过过滤器来除去任何不溶的物质，并灭菌处理。

78、作为本发明的进一步方案，所述抗真菌剂为嘧菌酯、克霉唑或链霉素。

79、作为本发明的进一步方案，制备所述诱导月季植物离体再生的培养基的方法，包括以下步骤：

80、步骤1、溶解ms培养基：

81、使用去离子水将1/2 ms培养基粉末溶解，配制得到基本ms培养基；其中，ms培养基粉末为无机盐、微量元素、碳源、固化剂以及ph调节剂的混合物；

82、步骤2、添加植物生长激素：

83、将准备的苄基腺嘌呤（bap）溶液和吲哚丁酸（iba）溶液添加至基本ms培养基中；其中，准备的苄基腺嘌呤（bap）溶液的浓度为0.5-2.0 mg/l，吲哚丁酸（iba）溶液的浓度为0.1-1.0 mg/l；

84、步骤3、添加维生素和氨基酸：

85、通过维生素混合物和氨基酸混合物配制维生素营养物溶液至0.1-10 mg/l的浓度，并添加至基本ms培养基中；

86、步骤4、添加植物抗氧化剂：

87、将多酚类化合物抗氧化剂配制至10-35 mg/l的浓度，并添加至基本ms培养基中；

88、步骤5、添加生长促进因子：

89、添加蛋白水解物至100-350 mg/l，酵母提取物至30-80 mg/l，并添加10%-20% v/v的椰奶；

90、步骤6、添加抗真菌剂：

91、配制抗真菌剂溶液，将选择的抗真菌剂配制至1-10 mg/l的浓度添加至基本ms培养基中，使用氢氧化钠（naoh）或盐酸（hcl）调整溶液的ph值至5.7-5.8；

92、步骤7、添加固化剂：

93、加入6-8 g/l的琼脂，加热至完全溶解，将配制好的培养基在121℃下高压灭菌20分钟，灭菌后待培养基稍微冷却，但未完全凝固时，分装到无菌的培养容器中。

94、作为本发明的进一步方案，在90℃条件下使待加入的琼脂维持液态状态，使用磁力搅拌器将琼脂溶液与调节ph值后基本ms培养基的混合溶液充分混合，然后将制备好的培养基高温高压灭菌后分装成所需的琴斯基瓶，在室温条件下凝固，以供实验使用。

95、本发明还提供了一种上述诱导月季植物离体再生的培养基在促进月季植物离体组织培养、再生和快速繁殖中的应用。

96、作为本发明的进一步方案，诱导月季植物离体再生的培养基在促进月季植物离体组织培养、再生和快速繁殖中的应用，包括以下应用步骤：

97、1.采集月季植物组织：从月季植物母株中采集包含两片健康叶片且长度在5-10厘米之间的茎段组织，作为离体培养的起始材料；其中，叶片的位置位于茎段的顶部或中部。

98、2.基于离体培养的初始化：将茎段放置在含有诱导月季植物离体再生培养基的琴斯基瓶中，并确保组织与培养基充分接触；其中，每个琴斯基瓶中放置2-10个茎段，以确保有足够的空间生长。

99、3.培养和再生：将琴斯基瓶放置在恒温室内，温度维持在22-25℃，相对湿度保持在60%-70%；提供间歇光照，光照强度约为3000 lux，使用12小时光照/12小时暗周期，培养时间为4-6周，以诱导根的生长。

100、4.转移至土壤：成功生成根的月季植物组织转移到含有通用花卉土壤的盆中，保持土壤湿润，维持温度在22-25℃，提供适当的光照，使新植株在自然环境下继续生长。

101、5.繁殖和育种：新植株用于繁殖，通过控制肥料和灌溉，可以促进植物的健康生长，进行育种试验时，调整不同植物的交配组合，以开发新的月季品种。

102、6.应用监测和记录：对离体培养的月季植物组织和新植株的生长状况进行定期监测和记录，定期测量植物的生长参数，包括高度、叶片数、花芽的形成，记录植物的生长情况，并根据生长情况优化培养条件和确保所期望的结果。

103、作为本发明的进一步方案，减少激素a（苄基腺嘌呤）的浓度至0.5 mg/l，以促进根的生长，其中，包括以下步骤：

104、步骤1.准备原料和物品：

105、高浓度的激素a溶液（初始溶液）；

106、新的培养基；

107、实验室玻璃器皿或容器；

108、毫升量杯；

109、实验室安全设备（实验室外套、手套和护目镜）；

110、恒温水浴。

111、步骤2.计算所需的稀释溶液：计算所需激素a的体积和浓度，从初始溶液中制备所需的稀释溶液；计算公式如下：

112、初始浓度x初始体积=最终浓度x最终体积

113、其中，初始浓度是高浓度激素a溶液的浓度（1.5 mg/l），初始体积是要取出的初始溶液的体积，最终浓度是0.5 mg/l，最终体积是要制备的最终稀释溶液的总体积。

114、即：根据初始浓度和最终浓度的计算可知，初始体积与最终体积的体积比为1:3。

115、步骤3.制备稀释溶液：

116、使用恒温水浴准备一个新的容器，作为稀释激素a的容器；

117、使用毫升量杯，测量初始溶液中所需体积的激素a；

118、将测量的初始溶液转移到新容器中；

119、使用新的培养基加入到新容器中，以达到所需的最终体积，确保充分混合。

120、步骤4.搅拌和混合：使用磁力搅拌器确保激素a均匀分布在新的溶液中。

121、步骤5.浓度检验：使用吸光度测定方法检验激素a的浓度是否达到所需的0.5 mg/l；如果浓度过高，继续稀释；如果浓度过低，则滴加初始溶液。

122、步骤6.记录数据：记录用于制备稀释溶液的初始溶液体积和浓度，以及最终稀释溶液的体积。

123、步骤7.实验使用：稀释后的激素a溶液可用于实验中，将之前的组织（具有新芽和叶片的茎段）小心地从之前的培养基中移至新培养基。确保组织在新培养基中充分浸泡；继续在适当的培养条件下培养组织，如光照、温度和湿度。新培养基中的低激素a浓度将有助于诱导根的生成。

124、与现有技术相比，本发明提供的诱导月季植物离体再生的培养基及其应用具有以下有益效果：

125、1.月季植物再生的可行性：本发明的培养基提供了在离体条件下诱导月季植物再生的途径，使得从一个母本植物可以快速繁殖出大量具有遗传一致性的后代，增加了月季植物的再生的可行性。

126、2.繁殖和育种：使用本发明的培养基，可以快速繁殖月季植物，产生具有相同遗传特性的新植株，通过组织培养再生的植物可以保持亲本的遗传特性，对于繁殖和育种项目非常有用，有助于培育新的月季品种。

127、3.控制生长：通过调整培养基中的植物生长激素和生长促进因子成分的浓度，可以实现对月季植物组织生长的精确控制，有助于优化再生过程。

128、综上所述，本发明为月季植物的离体再生提供了一个有效的工具，有助于加速月季植物的繁殖和育种过程，提高生长条件的可控性，降低了成本，并有助于实现可持续性的月季植物培育。