专利名称：:一种复合型早老性痴呆动物模型的构建方法
技术领域：
：本发明涉及医疗评价、检测技术，具体涉及用于筛选药物、研究疾病发生机制和评价药物疗效的动物模型的构建方法。技术背景早老性痴呆(AlzheimerDisease,AD)是一种常见的神经退行性疾病，其主要症状表现为记忆力减退，认知能力低下和思维迟钝，且进行性加重，最后生活不能自理而死亡，病程一般810年。随着社会老龄化进程的加快，AD的患病人数急剧上升，已成为威胁老龄特别是高龄人口身心健康的严重疾病，并带来了严重的社会、经济和家庭问题。AD病人主要脑病理改变是形成大量神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles,NFTs)和大量老年斑、其分子标志物分别是异常磷酸化的tau蛋白和e-淀粉样蛋白(A-beta)。国外学者已采用转基因技术，在小鼠成功地复制出P-淀粉样蛋白沉积形成的老年斑样病变，从而使得未来AD治疗将减少A-beta沉积作为药物干预的靶标成为可能。NFTs的数量与AD临床痴呆程度正相关。因此，干预NFTs对AD的防治尤为重要。自从发现NFTs的主要成分是异常、过度磷酸化的tau蛋白聚集形成的双螺旋丝以来，国内外学者普遍公认，骨架蛋白tau的异常、过度磷酸化是NFTs形成的关键步骤。过度磷酸化tau蛋白的聚集不仅以缠结的形式存在，它也是神经毡纤丝和老年斑中的营养不良突起的主要成分。因此，在体诱导tau蛋白的异常过度磷酸化、老年斑形成和记忆障碍，在AD研究中有重要意义。目前国外相关的大鼠模型有(1)转染tau蛋白激酶基因的大鼠模型，该模型能高表达过度磷酸化的tau蛋白(野生型或人类tau蛋白的突变异构体)，可重复间歇饥饿刺激和对胰岛素信号转导途径作用的药物如atr印tozotocin、tolbutamide、LY294002、wort隨nnin、PD98059等实验，但无行为学记忆障碍(JP2000253774);(2)脑组织注射岗田酸(Okadaicacid，OA)慢性损害模型，OA是一种磷酸酯酶抑制剂，通过微渗透泵输送到侧脑室，持续6周后，大鼠脑的纹状体、海马和皮质等部位出现高磷酸化tau蛋白免疫阳性神经元，并伴有工作记忆和参考记忆的损害(ArentT,1995);(3)通过大鼠侧脑室或海马注射蛋白激酶激动剂(wortmannin，WT)或抑制剂(GFX)诱导蛋白tau过度磷酸化的动物模型，尤其是联合用药(专利公开号CN1636601A)，该模型只是单次脑内注射，维持时间短。此外，方法(2)和(3)均需要脑内注射，操作难度大；三种方法均不能复制同时体现tau，A-beta和行为学异常的动物模型。
发明内容本发明的目的在于提供一种复合型早老性痴呆动物模型的构建方法，以构建出AD样老年斑、tau蛋白过度磷酸化与学习、记忆障碍同时出现的早老性痴呆动物模型。本发明提供的这种复合型早老性痴呆动物模型的构建方法，是给哺乳动物，如大鼠，注射同型半胱氨酸(homocystin，Hcy)，干扰甲基化反应，注射方法可以实施尾静脉注射、腹腔注射或侧脑室注射。实现本发明的技术方案是给哺乳动物注射同型半胱氨酸(homocystin，Hcy)，如给大鼠注射同型半胱氨酸构建复合型早老性痴呆动物模型，所述的注射可为尾静脉注射、腹腔注射或侧脑室注射。大鼠尾静脉注射方法是将大鼠在清醒状态下固定，从尾静脉缓慢注入(注射速度为lml/约IO秒)Hcy;腹腔注射方法是将大鼠在清醒状态下固定，从腹腔缓慢注入(注射速度为lml/约5秒)Hcy;大鼠侧脑室注射方法是将大鼠麻醉后固定在脑立体定位仪上，清晰暴露前后囟，于前囟后1.01.2隱，中线旁侧1.51.8mm垂直进针至硬膜下约3.53.8,，用牙科水泥固定留针，缓慢注入(注射速度为20pl/约lmin)Hcy。同型半胱氨酸homocystin的注射剂量为尾静脉注射每次注射浓度为100的同型半胱氨酸lml，每天1次，持续14天，或每周1次，持续半年；腹腔注射每次注射浓度为100pM的同型半胱氨酸lml，每天1次，持续14天，或每周l次，持续半年；侧脑室注射每次注射浓度为100一的同型半胱氨酸20pl，每天1次，持续14天。通过尾静脉或腹腔或侧脑室持续注射同型半胱氨酸(homocystin，Hcy)，能在大鼠复制出同时具有老年斑(A-beta沉积)、tau蛋白异常磷酸化和学习记忆障碍的复合型早老性痴呆大鼠模型。尾静脉注射和腹腔注射等外周注射法具有操作简单，重现性好，模型维持时间长，所需费用低等特点。以本发明方法构建的动物模型可用于筛选AD新药、评价临床治疗效果和用以研究发病机制等。本发明复合型早老性痴呆大鼠模型构建方法与现有技术的比较见表1。表1几种早老性痴呆大鼠模型的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>建立所需时间长6周2天15天15天学习记忆障碍无有有(维持时间短)有有作用机制蛋白激酶途径磷酸酯酶途径蛋白激酶途径干扰甲基化干扰甲基化成本很高高很低很低很低可操作性难(转基因)差(脑注射)差(脑注射)易差(脑注射)以大鼠为例，其尾静脉注射方法是将大鼠在清醒状态下固定，从尾静脉缓慢注入所选药物腹腔注射方法是将大鼠在清醒状态下固定，从腹腔缓慢注入所选药物；侧脑室注射方法是将大鼠麻醉后固定在脑立体定位仪上，清晰暴露前后囟，于前囟后1.01.2mm，中线旁侧1.51.8mm垂直进针至硬膜下约3.53.8咖，用牙科水泥固定留针，缓慢注入所选药物。所选用的同型半胱氨酸的浓度是100^M，注射体积是1ml，注射时间是15天。具体操作步骤如下1.尾静脉或腹腔或侧脑室注射给药(1)尾静脉或腹腔给药选择雄性Wistar大鼠，固定后在清醒情况下向尾静脉或腹腔缓慢注入Hcy药液lml，浓度为100一。(2)侧脑室注射给药将大鼠麻醉后固定在脑立体定位仪上，清晰暴露前后囟，于前囟后1.01.2mm，中线旁侧L51.8mm垂直进针至硬膜下约3.53.8酬，牙科水泥固定留针，缓慢注入Hcy药液20nl，浓度为IOO)iM，用灭菌人工脑脊液配置。2.Morris水迷宫训练及测试目的通过训练及测试来判断造模前后以及与对照组比大鼠学习记忆能力的变化。实验所采用Morris水迷宫测试系统主要包括大鼠行为学测试系统、图象采集系统及微机数据处理分析系统。测试用圆形水池直径120cm,高60cm;圆柱形有机玻璃平台直径10cm,高40cm。大鼠在训练前2h移入水迷宫室，并用染发剂将头颈部涂黑，涂染面积不小于3X3cm2，以与背景形成反差。水池中水面高约45cm，室温及水温均保持在26±2°C，水以奶粉搅浑；平台用双层白色纱布覆盖扎紧后任意放置于某一象限的中心位置，并没于水面下约2cm。整个背景均为乳白色，以避免老鼠用视觉搜寻平台。用于指导大鼠游泳找到平台的红色或兰色标记物分别置于平台所在象限边缘1m左右。训练时将大鼠从任一象限1/2弧度处头面向池壁轻放于水中，其游泳图像经水面上方1.5m处的摄像机拍摄并连接于路径追踪系统采集，最后通过微机分析，可提供潜伏期(即大鼠从入水点起到找到平台所用的时间)、路径、搜索策略等指标，本实验选用潜伏期作为衡量大鼠学习记忆和测试成绩的指标。每只大鼠每天在4个象限共训练4次，每次游泳时限为60s,即在60s内未找到平台者系统自动停止记录，潜伏期记为60s，由测试者引导其上台，休息30s后进行下一次训练。3.分子病理学检测目的通过免疫印迹和免疫组化来反映造模前后以及与对照组比大鼠脑组织tau蛋白和A-beta的分子病理学变化。(1)免疫印迹法颈椎脱臼断头处死大鼠，迅速取出大脑脑组织置于0-4°C0.05MTris缓冲盐溶液(TB，pH7.0)内，快速分离双侧海马，制成10%的蛋白匀浆，在1000rmp离心5分钟，取上清，测定蛋白含量后备用。(2)免疫组化法用4%多聚甲醛磷酸缓冲盐溶液(PB)进行心脏灌注固定脑组织，待取出脑组织后再在上述固定液中后固定6h，即可作振荡切片。免疫组化采用ABC法，二氨基联苯氨(diaminobezidin，應)显色。4.统计分析全部数据均采用又士SD表示，利用SPSS统计软件进行统计分析。5.模型的评估根据上述实验步骤进行操作，结果显示在大鼠尾静脉、腹腔或侧脑室注射Hcy(lOO一，1ml)14天后，模型鼠出现明显学习记忆障碍，即水迷宫测试潜伏期明显延长(图1);在大鼠的大脑皮层出现大量AD样老年斑(图2)、磷酸化的tau蛋白显色明显增强；磷酸化的tau蛋白水平明显升高(图3)。上述结果说明模型构建成功。本发明提供的动物模型的构建方法，同时适用于(l)在大鼠腹腔注射Hcy(lOO]LiM，lml)14天；(2)在大鼠侧脑室注射Hcy(100(iM，20pl)14天；(3)通过大鼠双侧海马注射Hcy(100^M，2pl)14天等，都可以直接复制出AD样骨架蛋白异常过度磷酸化、老年斑样病理变化和学习记忆障碍。图1为大鼠尾静脉注射Hcy对大鼠空间学习记忆的影响实验结果图水迷宫研究结果显示与对照组相比较，注射lml(100(iM或350)iM)Hcy能明显延长潜伏期，即大鼠找到安全平台的时间(n=15;*,p<0.05)。说明注射Hcy导致大鼠空间记忆障碍。图2为大鼠尾静脉注射Hcy导致AD样老年斑块的形成实验结果图大鼠尾静脉注射Hcy导致AD样老年斑块的形成的实验操作是用4%多聚甲醛磷酸缓冲盐溶液进行心脏灌注固定脑组织，取出脑组织后再在上述固定液中后固定6h，作振荡切片及用ABC法作免疫组化用DAB显色。结果显示(见图2):与对照组相比较，注射1ml(100pM)Hcy组大鼠的大脑皮质出现大量老年斑样显色(见箭头标示，n=15)。A,C，F为对照组；B,D,E,G，H,I为模型组。A，B为海马神经元(X40);C，D,E为皮质神经元(X400);F,G,H，I为皮质神经元(XIOOO)。图3:大鼠尾静脉注射Hcy导致AD样tau蛋白异常过度磷酸化实验结果图大鼠尾静脉注射Hcy导致AD样tau蛋白异常过度磷酸化的实验操作是用4%多聚甲醛磷酸缓冲盐溶液进行心脏灌注固定脑组织，取出脑组织后再在上述固定液中后固定6h，作振荡切片及用ABC法作免疫组化用DAB显色。结果显示(见图3):与对照组相比较，注射1ml(lOOHM)HCy组大鼠的大脑皮质和海马区出现明显的tau蛋白异常过度磷酸化(f15;*，/XO.OD。表现为tau-l(识别非磷酸化位点)抗体着色减弱，PHF-1(识别磷酸化位点)抗体着色增强(见箭头标示，n=15)。具体实施方式实例1尾静脉注射同型半胱氨酸(Hcy)构建AD样大鼠动物模型(1)实验动物及分组雄性Wistar大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物实验中心提供)，SPF级，体重250320克，90只，常规环境饲养。分6组，每组15只①正常组；②假手术组；③Hcy组l(lOOpM);④Hcy组2(350一)；⑤Hcy组l+叶酸/VitB12;⑥Hcy组2+叶酸/VitB12。(2)主要试剂丙烯酰胺(Arc),N，N-亚甲基双丙烯酰(bis)，四甲基乙二胺(TEMED)，十二垸基磺酸钠(SDS)，甘氨酸(Glycine),牛血清白蛋白(BSA)，三羟甲基氨基甲垸(Tris)，矾酸钠(Na3V04)，e-磷酸甘油(e-PG)，氟化钠(NaF),Hcy为Sigma产品;过硫酸铵(AP)及考马斯亮蓝蛋白显色液从Pierce(美国)公司购买；预染的高分子量蛋白标准从Gibco公司购买。(3)主要仪器WDT-V型脑立体定位仪(西安西北光电仪器厂)STT-III型三维手动推进器(西安西北光电仪器厂)垂直型电泳槽和湿式电转膜槽(Hoefer，USA)电泳仪(DF-C型，东方特力科贸中心)转膜仪(BIO-RAD，北京市六一仪器厂)台式高速离心机(Sigma，德国)酶标仪(DG-3022型)图象分析系统(Imagepro-pluskodak,USA)衡温杂交孵育箱(Biometra)脑立体定位注射仪(日本)(4)尾静脉注射给药将大鼠在清醒状态下固定，从尾静脉缓慢注入1mlHey(Hey组1为100;Hey组2为350pM)。(5)Morris水迷宫训练及测试实验所采用Morris水迷宫测试系统主要包括大鼠行为学测试系统、图象采集系统及微机数据处理分析系统。测试用圆形水池直径120cm，高60cm;圆柱形有机玻璃平台直径10cm,高40cm。大鼠在训练前2小时移入水迷宫室，并用染发剂将头颈部涂黑，涂染面积不小于3X3cm2，以与背景形成反差。水池中水面高约45cm,室温及水温均保持在26±2°C,水以奶粉搅浑；平台用双层白色纱布覆盖扎紧后任意放置于某一象限的中心位置，并没于水面下约2cm。整个背景均为乳白色，以避免老鼠用视觉搜寻平台。用于指导大鼠游泳找到平台的红色或兰色标记物分别置于平台所在象限边缘1m左右。训练时将大鼠从任一象限1/2弧度处头面向池壁轻放于水中，其游泳图象经水面上方1.5m处的摄象机拍摄并连接于路径追踪系统采集，最后通过微机分析，可提供潜伏期(即大鼠从入水点起到找到平台所用的时间)、路径、搜索策略等指标，本实验选用潜伏期作为衡量大鼠学习记忆和测试成绩的指标。每只大鼠每天在4个象限共训练4次，每次游泳时限为60s,即在60s内未找到平台者系统自动停止记录，潜伏期记为60s，由测试者引导其上台，休息30s后进行下一次训练。(6)分子病理学检测目的通过免疫印迹和免疫组化来反映造模前后以及与对照组大鼠海马骨架蛋白的分子病理学变化。免疫印迹法颈椎脱臼断头处死雄性Wistar大鼠，迅速取出大脑脑组织置于0-4'C0.05MTris缓冲盐溶液(TB，PH7.0)内，快速分离双侧海马，制成10%的蛋白匀浆，在1000r卿离心5分钟，取上清，测定蛋白含量后备用。免疫组化法用4%多聚甲醛磷酸缓冲盐溶液(PB)进行心脏灌注固定脑组织，待取出脑组织后再在上述固定液中后固定6h，即可作振荡切片。免疫组化采用ABC法，二氨基联苯氨(diaminobezidin，鹏)显色。(8)统计分析全部数据均采用又土SD表示，利用SPSS统计软件进行统计分析。(9)模型构建评估根据上述实验步骤进行操作，结果显示通过大鼠尾静脉注射lml(100^M)同型半胱氨酸M天，大鼠出现明显学习记忆障碍，即水迷宫测试潜伏期明显延长；免疫组化和免疫印迹结果显示在手术48h后，与对照组相比，模型组大鼠的大脑皮质出现大量老年斑，大脑皮质和海马区骨架蛋白tau磷酸化程度明显增强。上述结果说明模型构建成功。结论通过大鼠尾静脉注射lml(lOOpM)同型半胱氨酸14天，成功构建了同时显现学习记忆障碍、大量老年斑形成和tau异常磷酸化的动物模型。实例2腹腔注射同型半胱氨酸(Hcy)构建AD样大鼠动物模型除注射途径不同以外，其他操作和结果与实例1相同结论通过大鼠腹腔注射lml(100pM)同型半胱氨酸14天，成功构建了同时显现学习记忆障碍、大量老年斑形成和tau异常磷酸化的动物模型。实例3侧脑室注射同型半胱氨酸(Hcy)构建AD样大鼠动物模型(1)实验动物、分组、试剂、仪器设备以及模型的评估同实例1(2)侧脑室注射给药将大鼠麻醉后固定在脑立体定位仪上，清晰暴露前后囟，于前図后1.01.2mm,中线旁侧L51.8mm垂直进针至硬膜下约3.53.8mm，固定留针，缓慢注入Hcy药液20)^1(100-)，每天1次，注射14天。(3)模型的评估同实例1结论通过大鼠腹腔注射lml(100^M)同型半胱氨酸14天，成功构建了同时显现学习记忆障碍、大量老年斑形成和tau异常磷酸化的动物模型。权利要求1.一种复合型早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于，给哺乳动物注射同型半胱氨酸homocystin。2.根据权利要求1所述的复合型早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于，所述的哺乳动物为大鼠。3.根据权利要求2所述的复合型早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于，所述的注射为尾静脉注射。4.根据权利要求3所述的复合型早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于，所述的尾静脉注射方法是将大鼠在清醒状态下固定，从尾静脉缓慢注入同型半胱氨酸。5.根据权利要求2所述的复合型早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于，所述的注射为腹腔注射。6.根据权利要求5所述的复合型早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于，所述的腹腔注射方法是将大鼠在清醒状态下固定，从腹腔缓慢注入同型半胱氨酸。7.根据权利要求1至6中任一项所述的早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于，所述的药物同型半胱氨酸homocystin的注射剂量为每次注射浓度为100的同型半胱氨酸1ml，每天1次，持续14天。8.根据权利要求1至6中任一项所述的早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于，所述的药物同型半胱氨酸homocystin的注射剂量为每次注射浓度为100的同型半胱氨酸1ml，每周1次，持续半年。9.根据权利要求2所述的复合型早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于，所述的注射为大鼠侧脑室注射。10.根据权利要求9所述的复合型早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于，所述的大鼠侧脑室注射方法是将大鼠麻醉后固定在脑立体定位仪上，清晰暴露前后囟，于前囟后1.01.2mm,中线旁侧1.51.8mm垂直进针至硬膜下约3.53.8mm，用牙科水泥固定留针，缓慢注入同型半胱氨酸，每次注射浓度为100一的所述药物同型半胱氨酸.20每天1次，持续14天。专利摘要本发明提供了通过大鼠尾静脉、腹腔或侧脑室注射同型半胱氨酸(homocystin，Hcy)构建早老性痴呆大鼠模型的方法，该方法能诱导大鼠大脑皮质和海马区淀粉样蛋白沉积并形成老年斑、骨架蛋白tau发生异常过度磷酸化、以及出现学习、记忆障碍等复合病征。该模型可用于早老性痴呆预防和治疗新药的筛选、药物治疗效果的评价及其发病机制研究。文档编号A01K67/00GKCN101107924SQ200610019659公开日2008年1月23日申请日期2006年7月18日发明者王建枝申请人:华中科技大学同济医学院导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan