专利名称:岱衢族大黄鱼与闽粤东族养殖大黄鱼的杂交方法
技术领域：
本发明涉及一种大黄鱼，尤其是涉及一种岱衢族大黄鱼与闽粤东族养殖大黄鱼的杂交方法。
背景技术：
我国沿海大黄鱼存在3个地理种群，它们在寿命、性成熟年龄和种群年龄组成等方面存在明显差异。以浙江北部岱衢洋为代表的岱衢族大黄鱼具有寿命最长(雌鱼最高29龄，雄鱼27龄)、大量性成熟年龄较迟(雄鱼为3龄，雌鱼3龄和4龄)、种群组成最复杂，剩余种群占着稳定优势等特点；以广东西部硇洲为代表的硇洲族大黄鱼具有寿命最短(雄鱼最高8龄，雌鱼9龄)、大量性成熟年龄较早(1龄就有少数个体开始性成熟，大量个体在2-3龄性成熟)、种群组成简单和补充种群所占比例增大；以福建北部官井洋为代表的闽粤东族大黄鱼的特点则介于岱衢族和硇洲族之间。显著的种群差异预示着进行大黄鱼种内杂交是一项十分有意义的工作，亲本间的遗传差异越显著，子代的杂种优势也可能越具有经济价值和应用价值。
大黄鱼不仅所处的地理位置不同，性成熟的时间也不同步。由于大黄鱼成鱼的远程运输十分困难，这些都严重阻碍大黄鱼种群间杂交的顺利进行。
本申请人在公开号为CN1586430的发明专利申请中提供一种石首鱼类精子激发大黄鱼雌核发育二倍体的诱导方法，该方法采用人工受精，将杂交组合中同科不同种父本的精子与大黄鱼的卵混合；将精卵混合后，用海水激活将受精卵放入压力容器，施压；达到靶压力38～55MPa时停止施压；持续1～30min后降压，完成压力休克的诱导。
发明内容
本发明的目的在于针对岱衢族与闽粤东族养殖大黄鱼2个种群大黄鱼在性腺成熟时间上不同步的问题，提供一种杂交后代具有生长快、抗逆性强、适于长途运输等优点的岱衢族大黄鱼与闽粤东族养殖大黄鱼的杂交方法。
本发明的具体操作如下1)选取闽粤东族养殖大黄鱼雄鱼父本，轻压腹部有乳白色精液流出者留用；2)配置精子稀释液；3)挤压雄鱼腹部，吸取无血无尿的乳白色精液，经镜检精子活力在90％以上者用于冷冻保存；4)将精子稀释液与抗冻剂混匀再加入精子，混匀后贮存于冻存管中，分装好的冻存管密封后置于4℃环境中，再置于液氮上方降温后移入液氮保存备用；5)选取岱衢族野生大黄鱼雌鱼母本，进行催产；6)当大黄鱼母本卵子成熟时开始解冻精液，将装有精子的冻存管从液氮中取出后立即投入室温淡水中解冻，解冻后的精子用海水激活，同时进行人工授精；7)人工授精后，用新鲜海水反复冲洗受精卵，及时去除下沉的坏卵，充气孵化。
在步骤1)中，所述的闽粤东族养殖大黄鱼雄鱼父本最好为体形完整，身体健康，腹部柔软的闽粤东族养殖大黄鱼雄鱼父本。
在步骤2)中所述的配置精子稀释液以每100mL精子稀释液含葡萄糖1.45g；柠檬酸钠0.2g；KCl0.03g；BSA(小牛血清白蛋白)3g；调节pH为5.6～6.0。
在步骤3)中，精子∶精子稀释液∶抗冻剂＝3∶6∶1，其中抗冻剂使用二甲亚砜(DMSO)。
在步骤4)中，按比例将稀释液与抗冻剂混匀再加入精子，混匀后贮存于1.8mL的冻存管中，分装好的冻存管密封后，置于4℃环境中降温平衡40min，再置于液氮上方降温平衡30min后移入液氮保存备用。
在步骤5)中，所述的岱衢族野生大黄鱼雌鱼母本选取体形完整、游动活泼，腹部柔软，泄殖孔微红的岱衢族野生大黄鱼雌鱼母本，按每Kg鱼重注射1～3ug LHRH-A2进行催产，水温22～24℃，激素效应期为36h。
在步骤7)中，最好人工授精5～10min后，用新鲜海水反复冲洗受精卵。
本发明首先对大黄鱼4个群体的遗传背景进行分析，通过RAPD、ISSR等现代分子生物学技术的检测和确认，通过进一步实验发现以岱衢族野生大黄鱼为母本，闽粤东族养殖大黄鱼为父本的杂交组合所产生的后代杂种优势最显著，不存在生殖隔离。确定了以岱衢族野生大黄鱼为母本闽粤东族养殖大黄鱼为父本的杂交组合。
应用精子冷冻保存的方法不仅能够克服不同种群间个体性成熟的时间差异，也能够克服不同种群所处的空间差异，从而可以有效解决大黄鱼种内杂交在时空上的隔离的困难。
本发明的优点可归纳为1.杂交组合是以前期的实验结果为依据，确保杂交组合的杂种优势最显著；2.应用精子冷冻保存的方法克服了岱衢族野生大黄鱼与闽粤东族养殖大黄鱼在性成熟时间上差异，同时解决了两者在地理上的隔离；3.杂交产生的后代具有生长快、抗逆性强、适于长途运输等优点。
具体实施方式
1.在福建选取个体体形完整、身体健康、腹部柔软的闽粤东族养殖大黄鱼雄鱼2尾，轻压腹部有乳白色精液流出者留用。
2.配置精子稀释液。每100mL精子稀释液含葡萄糖1.45g；柠檬酸钠0.2g；KCL0.03g；BSA(小牛血清白蛋白)3g；调节pH到5.6～6.0。
3.挤压雄鱼腹部，吸取无血无尿的乳白色精液，经镜检精子活力在91％，留用。精子∶稀释液∶抗冻剂的比例为3∶6∶1，其中抗冻剂使用二甲亚砜(DMSO)。
4.按比例将稀释液与抗冻剂混匀再加入精子，彻底混匀后贮存于1.8mL的冻存管中。分装好的冻存管密封后，置于4℃环境中降温平衡40min，再置于液氮上方降温平衡30min后移入液氮保存。将冷冻保存的精液运输到岱衢族野生大黄鱼的产区——浙江。
4.选取体形完整、游动活泼，腹部柔软，泄殖孔微红的岱衢族野生大黄鱼雌鱼5尾。按每Kg鱼重注射2ug LHRH-A2进行催产。水温23℃，激素效应期约为36h。
5.当大黄鱼母本卵子成熟时开始解冻精液，将装有精子的冻存管从液氮中取出后立即投入室温淡水中解冻。解冻后的精子用海水激活，同时进行于人工授精。
6.人工授精50min后，用新鲜海水反复冲洗受精卵，及时去除下沉的坏卵，充气孵化。
权利要求
1.岱衢族大黄鱼与闽粤东族养殖大黄鱼的杂交方法，其特征在于其操作如下1)选取闽粤东族养殖大黄鱼雄鱼父本，轻压腹部有乳白色精液流出者留用；2)配置精子稀释液；3)挤压雄鱼腹部，吸取乳白色精液，经镜检精子活力在90％以上者用于冷冻保存；4)将精子稀释液与抗冻剂混匀再加入精子，混匀后贮存于冻存管中，分装好的冻存管密封后置于4℃环境中，再置于液氮上方降温后移入液氮保存备用；5)选取岱衢族野生大黄鱼雌鱼母本，进行催产；6)当大黄鱼母本卵子成熟时开始解冻精液，将装有精子的冻存管从液氮中取出后立即投入室温淡水中解冻，解冻后的精子用海水激活，同时进行人工授精；7)人工授精后，用新鲜海水反复冲洗受精卵，及时去除下沉的坏卵，充气孵化。
2.如权利要求
1所述的岱衢族大黄鱼与闽粤东族养殖大黄鱼的杂交方法，其特征在于在步骤1)中，所述的闽粤东族养殖大黄鱼雄鱼父本为体形完整，身体健康，腹部柔软的闽粤东族养殖大黄鱼雄鱼父本。
3.如权利要求
1所述的岱衢族大黄鱼与闽粤东族养殖大黄鱼的杂交方法，其特征在于在步骤2)中所述的配置精子稀释液以每100mL精子稀释液含葡萄糖1.45g；柠檬酸钠0.2g；KCl0.03g；小牛血清白蛋白3g；调节pH为5.6～6.0。
4.如权利要求
1所述的岱衢族大黄鱼与闽粤东族养殖大黄鱼的杂交方法，其特征在于在步骤3)中，精子∶精子稀释液∶抗冻剂＝3∶6∶1。
5.如权利要求
1或4所述的岱衢族大黄鱼与闽粤东族养殖大黄鱼的杂交方法，其特征在于抗冻剂为二甲亚砜。
6.如权利要求
1所述的岱衢族大黄鱼与闽粤东族养殖大黄鱼的杂交方法，其特征在于在步骤4)中，按比例将稀释液与抗冻剂混匀再加入精子，混匀后贮存于1.8mL的冻存管中，分装好的冻存管密封后，置于4℃环境中降温平衡40min，再置于液氮上方降温平衡30min后移入液氮保存备用。
7.如权利要求
1所述的岱衢族大黄鱼与闽粤东族养殖大黄鱼的杂交方法，其特征在于在步骤5)中，所述的岱衢族野生大黄鱼雌鱼母本选取体形完整、游动活泼，腹部柔软，泄殖孔微红的岱衢族野生大黄鱼雌鱼母本，按每Kg鱼重注射1～3ug LHRH-A2进行催产，水温22～24℃，激素效应期为36h。
8.如权利要求
1所述的岱衢族大黄鱼与闽粤东族养殖大黄鱼的杂交方法，其特征在于在步骤7)中，最好人工授精5～10min后，用新鲜海水反复冲洗受精卵。
专利摘要
岱衢族大黄鱼与闽粤东族养殖大黄鱼的杂交方法，涉及一种大黄鱼。提供一种杂交后代具有生长快、抗逆性强、适于长途运输等优点的岱衢族大黄鱼与闽粤东族养殖大黄鱼的杂交方法。选取闽粤东族养殖大黄鱼雄鱼父本，轻压腹部有乳白色精液流出者留用；配置稀释液；挤压雄鱼腹部，吸取精液，经镜检精子活力在90％以上者用于冷冻保存；将稀释液与抗冻剂混匀再加入精子，贮存于冻存管中，密封后置于4℃中，再置于液氮上方降温后移入液氮保存；选取岱衢族野生大黄鱼雌鱼母本催产；当大黄鱼母本卵子成熟时解冻精液，将装有精子的冻存管从液氮中取出投入室温淡水中解冻，用海水激活，人工授精后，用海水冲洗受精卵，去除下沉的坏卵，充气孵化。
文档编号A61D19/00GKCN1951183SQ200610135260
公开日2007年4月25日 申请日期2006年11月28日
发明者王德祥, 苏永全, 王军 申请人:厦门大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan