专利名称:从性熟鱼中获取适于受精的性产物的方法
本发明叙述在与鱼的自然产卵季节无关的期间内，从性成熟鱼中获取适于受精的性产物的方法。
我们知道，雌鱼和雄鱼的性活动由鱼的腺垂体释放出的促性腺激素调节。这类激素制约性腺的形态和功能的形成，性腺的成熟，以及性腺的配子发生活性(卵子和精子的产生)(性腺)和性腺激素的分泌。
在两种性别的个体中，腺垂体均释放出同样两种促性腺激素。其中之一称为FSH(促卵泡激素)，另一个称为LH(促黄体激素)，或者根据其在雄体中的作用称为ICSH(促间质细胞激素)。
我们还知道，这两种激素并不显示对性别的特异性，因为同样的FSH对雄体和雌体中产生配子的活性都有影响，并且同样的LH或ICSH都将诱导雄体中雄激素的分泌及雌体中雌激素或孕酮的分泌。
FSH和LH均为糖蛋白，它们对鱼类显示很强的种属特异性。
鱼的(脑)垂体使鱼的内分泌系统许多功能完整化，该(脑)垂体在内分泌系统与神经系统之间也具有某些协调功能，这主要通过间脑的丘脑下部区域中自主神经系统的核团来实现。此外，(脑)垂体在具有种属特异性促激素的协助下调节生殖周期。
在正常条件下，鱼的排卵发生在某种鱼所特有的产卵环境之中。成熟的卵并不自动进行排卵，它们仍处在或长或短的潜伏期内，直至适当的条件形成。鱼的这种生殖适应特性是由鱼的脑垂体和中枢神经系统联合控制。在潜伏期内，鱼的机体处于平衡状态，释放促性腺激素的能力非常低，因此，仅有很少量的促性腺激素在这时被释放到血液。测定鱼的最佳产卵条件的准确时间是不可能的，因为产卵条件的形成在某段期间内(如晚春或初夏)或多或少具有偶然性。这就意味着鱼类繁殖的调节机制使其生殖周期可以适应外界环境。鱼体内的这种调节由鱼的丘脑下部一脑垂体系统协调。
根据最近几年的研究，人们已经认识到，神经激素调节腺垂体中某些促激素的释放。神经激素从末梢神经出来，传到丘脑下部的某些核团处，立即被所谓的门脉毛细管吸收。由此，这些神经激素通过血液直接到达腺垂体窦处。
就目前为止所知的神经激素均为寡肽或多肽。诱导促激素分泌的神经激素称为“释放因子”(RF)，而抑制促激素分泌的神经激素称为“抑制因子”(IF)。根据最近的命名法，对于已知其结构和功能的神经激素，使用“释放激素”(RH)或“释放抑制激素”(RIH)这类术语。
所有神经激素都有这样的特征，即它们在去垂体动物体内的作用类似于在加入促激素之后观察到的作用。
鱼垂体的嗜碱细胞呈季节性变化，其数量在产卵期间减少。在对环境的适应过程中，产生了释放激素(RH)，这些激素通过血液流入脑垂体，调节其中促激素释放到血液。由此，鱼得到存在合适的外界产卵条件的信息。结果，促黄体素释放激素(LH-RH)(促黄体激素调节激素)激活脑垂体，并使其向血液中释放促性腺激素，从而开始产卵过程〔布雷顿B和韦尔cl，巴黎，科学院报(C.R.Acad.Sc.，Paris)，1973年277期，2061～2064页〕。
由在产卵处所产生的感觉神经冲动以这种方式传递到内分泌系统，该机制活化了一直处于强制潜伏期的生殖系统。根据子代生存的观点，此时能够检测出最佳外界环境(格比尔斯基，同上述)。
神经激素具有高度种间特性。鱼体内促黄体激素和释放激素的顺序不同于哺乳动物。因此，当两种激素互换时，没有效能。
由于发现了垂体技术，以及该技术在世界范围内扩大使用，鱼的人工诱导繁殖已经成为可能(格比尔斯基，同上述)。
为了用激素诱导产卵而从成熟或接近成熟的普通鲤科鱼中收集的脑垂体，经过适当的保存之后，已被普遍使用。迄今所试用的其它天然或合成的激素则尚无一致的实验结果。
这种普通鲤科鱼普通养殖，全世界各地蕴藏量很大。因此能够轻而易举地收集到足够量的脑垂体，以满足生产目的。普通鲤科鱼的脑垂体也可以成功地用于繁殖其他几种养殖的鱼。分类上远缘的鱼种(如鲟)属于例外。对这类鱼则使用由其同种的脑垂体而制备的激素悬浮液。
脑垂体的收集和保存均用同样的方法，与其供体种类无关。脑垂体应该从较成熟的的(尽可能是性成熟的)鱼中收集，但这种可能性非常小。脑垂体在小鱼体内更小，因为使用时以重量计，所以从小鱼身上收集脑垂体时需要大量的供体鱼。
根据已知方法，垂体用丙酮干燥。在丙酮中浸泡3次，每次8至12小时之后，垂体脱去水和脂肪。硬化以后，脑垂体在室温下干燥24小时，同时丙酮被蒸发出来。丙酮无损于垂体的促性腺活性成分。以上述方式干燥的垂体能贮存较长的时间而没有损失。
为了活化促性腺激素，将腺体在瓷研钵中磨碎，激素溶解在鱼的生理盐水溶液中(含0.65%NaCl)。
激素溶液要注入鱼的肌肉，以避免倒流出来或任何其它损失。如果是小鱼或肌肉松弛的鱼，注射液要注入鱼的体腔。注射的垂体激素与在发现产卵环境时鱼本身释放的激素所起作用相同，它们均引发产卵过程。
尽管鱼的养殖广泛采用垂体技术，但并非在所有情况下均能奏效。其主要原因如下
a)由于不知道供体鱼(从这些鱼身上收集脑垂体)的成熟期，所以也不知道垂体的促性腺激素含量。因此即便计算使用量时加以各种限制，其效果仍不确定。
b)普通鲤科鱼垂体的激素仅对一般鲤科鱼类和分类上非远缘的鱼种有效。因此，从经济观点看很重要的几种鱼，其繁殖率很低或根本不能繁殖。
c)使用普通鲤科鱼(或任何其它品种)的垂体，在大生产条件下，只能获得促黄体激素的效果。通过这种方法，不能产生促卵泡激素的效果，这可能是由于a)段中提到的原因所致。
d)由于没有促卵泡激素的作用，垂体技术只能用于诱导卵成熟的鱼排卵。
e)采用垂体技术，人工诱导繁殖只能在产卵季节进行，这意味着繁殖的可能性仅限于一年中的几天之内。因此生产设备的使用也受到限制。
f)只能从不成熟的鱼中大量收集脑垂体。这种垂体的特征是促性腺活性低。只有杀死有价值的供体鱼，才可能从成熟鱼中收集脑垂体。
本发明目的是详细描述一个方法，该法能够从任何成熟鱼种中获得用于自然受精或人工受精的性产物。
本发明基于如下认识，即如果用新的促性腺激素的衍生物施给成熟鱼的有机体，则上述目的完全能够达到。我们已经发现，从鱼的丘脑下部分泌出的促卵泡激素/促黄体激素一释放激素能够成功地用上述化合物代替。就是说，注入这些化合物可以成功地诱导精子和卵子的生成和排卵。
如上所述，本发明揭示在与鱼的自然产卵季节无关的期间内，从性成熟鱼中获取适于受精的性产物的方法。采用该方法，性成熟鱼的性产物(精子和卵子)的实际成熟期由探测方法测定;尚未成熟而不能排卵的鱼从成熟鱼中分出来;起激素作用的化合物施用于鱼体;在排卵之后，从鱼体或其环境中获得性产物。
根据本发明，将具有分子通式(Ⅰ)的九肽-C1-4烷基-酰胺和十肽酰胺及其盐和金属络合物(做为起激素作用的化合物)引入鱼体内，剂量为0.1微克～5毫克，2～500微克比较好，最好是5～100微克。如果鱼不成熟尚不能排卵，上述剂量至少分二次注入，最多不超过十二次。其中最后一次剂量至少与前一次相同或最好至少比前一次大1.5倍。
通式(Ⅰ)焦谷氨酰-组氨酰-色氨酰-丝氨酰-酪氨酰-X1-X2-X3-脯氨酰-X4其中，X1是甘氨酰基或任何天然或合成氨基酸残基的D-异构体，X2表示在侧链上含1～4个碳原子的L-氨基酸残基、L-苯丙氨酰基或L-色氨酰基，X3表示侧链为含1～4个碳原子烷基或侧链为含2～4个碳原子烷氧基-酰胺的L-氨基酸残基，X4是甘氨酸-酰胺或1～4个碳原子烷基-酰胺基。
上述分子式的缩写符合肽化学界认可并已出版的命名法，例如《生物化学杂志》(1966年第241卷527页，1972年第247卷977页)曾报道过该命名法。
该化合物无毒，即便过量使用亦无付作用。
如果处理不成熟而不能排卵的鱼，注射次数取决于该鱼距成熟排卵期的时间长短。这段时间愈短，注射次数愈少。
对于成熟而能排卵的鱼，若属雄性，则其精子与水接触时能够运动;若属雌性，则其细胞核附着在卵细胞的边缘。
按照本发明的方法，在通式(Ⅰ)的化合物之中，使用具有式Ⅱ和式Ⅲ的十肽化合物有特殊优点焦谷氨酰-组氨酰-色氨酰-丝氨酰-酪氨酰-D-苯丙氨酰-亮氨酰-谷氨酰胺-脯氨酰-甘氨酸-NH2(Ⅱ)焦谷氨酰-组氨酰-色氨酰-丝氨酰-酪氨酰-D-苯丙氨酰-色氨酰-亮氨酰-脯氨酰-甘氨酸-NH2(Ⅲ)制备本发明方法所使用的具有通式(Ⅰ)的化合物，可采用固相合成肽技术(梅里菲尔德R.B.美国化学家学会会誌，1963年85卷2149～2151页)。依据所需化合物的结构，如果制备烷基酰胺肽，则优先使用二苯甲基胺树脂。采用二环己基碳化工亚胺(DCC)，N，N′-二异丙基碳化二亚胺(DIC)或活化酯方法，可将氨基酸连结到上述树酯上，做为它们的N-α-叔-丁氧羰酰衍生物。最终产品可用酸或碱裂解技术从固相支持物上分离出来。
根据各种氨基酸成分的化学特性，通过适当组合分步合成和片段缩合，可用合适的保护氨基酸制备所需要的具有通式(Ⅰ)的最终产品。
本发明方法的主要优点如下a)该法使与普通鲤科鱼在分类上远缘的鱼种的繁殖成为可能。由于缺少种特异的脑垂体，这类鱼以前没有繁殖过。
b)该法可以在很宽的生态限度内使用，因为通式(Ⅰ)的化合物即使在完全不同的生物条件下也能发挥生理作用。
c)该法能在非自然产卵季节内繁殖鱼种，同时能够充分利用生产设备。
d)该法能消除因脑垂体用量不精确而造成不排卵的情况。
e)本发明方法使用的活性成份能够在实验室中合成，因此可以克服已知垂体技术所特有的效果不稳定的缺点。
f)本发明使用的合成激素的作用与鱼本身释放的促性腺激素的作用相同。
g)本方法用的合成激素无种间特异性，因此对分类上差异大的鱼种，该激素也有效。
以下实例将进一步描述本发明方法，但不限定保护范围。
例1人工诱导繁殖小体鲟(Acipenser ruthenus L.)从某一产地的种群中选择出成熟的鱼，然后将其运至繁殖处。将雄鱼和雌鱼分开，测定雌鱼卵的成熟期。如果细胞核附着在卵细胞的边缘，则认为鱼已成熟可以排卵。雄鱼的精子不必检查，因为某一产地种群中雄体和雌体的性产物实际上处于同一成熟期。如果鱼已成熟可以排卵，每条鱼(包括雄鱼)一次注入70微克分子式(Ⅱ)的十肽。
如果鱼不成熟尚不能排卵，则应将该鱼保存在自然产卵的温度下，并应注入上述化合物，每次用量10微克，至少二次，最多十二次，以细胞核从细胞中心移到边缘为准。处理次数取决于与“排卵成熟”期相比，性产物成熟的实际时期。这个成熟过程至少持续100个日度，最多不超过630个日度。温度范围为12～18℃。(日度等于天数乘上成熟期间所用水的平均温度)。
注入最后一次剂量24～32小时后，排卵开始进行。之后可于40～60分钟内得到性产物。
例2人工诱导繁殖普通鲤鱼(Cyprinus Carpio L.)将成熟的育种鱼在一年中的任意季节和任意温度下从其群体中选择出来，运至繁殖场所。分离两种性别的鱼。然后根据例1测定性产物的成熟期。如果鱼的排卵成熟，则一次注入70微克式(Ⅲ)的十肽化合物，包括雄鱼在内。
尚不成熟而不能排卵鱼应保持在自然产卵的温度下，同时应注入上述化合物，每次剂量5微克，至少2次，最多15次，以细胞核从卵细胞中心移到边缘处为准。注入处理的次数取决于与“排卵成熟”期相比，性产物的实际成熟期。这个成熟过程至少持续100日度，至多750日度，温度范围为20～40℃。
最后一次注入240～260时度后，排卵过程发生。然后于40～60分钟内剥离性产物。
例3人工诱导繁殖河鲈(Perca fluviatilis L.)从某一种群中选出成熟的鱼，运至繁殖处。根据例1测定性产物的成熟性，但不分开两种性别的鱼。对成熟能够排卵的鱼(包括雄鱼)，用一次剂量为20微克式Ⅱ的十肽化合物处理。
尚不成熟而不能排卵的鱼应保持在自然产卵温度下，每次以2微克的剂量注入上述化合物，至少2次，最多10次，以卵细胞的细胞核从细胞中心移到边缘为准。处理次数取决于与“排卵成熟”期相比，性产物的实际成熟期。成熟过程至少持续100日度，对极少的情况，持续多达400日度，水温范围为12～16℃。
最后一剂量注入之后24至36小时即发生产卵。鲈鱼在水池中较易进行人工产卵。在这种情况下，没有必要剥离性产物。
例4人工诱导繁殖竹筴鱼(Trachurus trachurus L.)从十一月份在亚得里亚海捕捉的活竹筴鱼中，选择鱼身长为240毫米的样品，将其运到繁殖场所。(这种规格的鱼，已性成熟)。将10微克剂量的式(Ⅱ)化合物一次注入每条鱼中。24小时后发生排卵，水温为18～24℃。二小时后即得到性产物。
对于竹筴鱼，没有必要测定成熟期和性别，因为实际上成熟的鱼不定量。
例5人工诱导繁殖狗鱼(Esox lucius L.)从某一种群之中选择出性成熟鱼，然后运到繁殖地。分离两种性别的鱼，根据例1测定性产物的成熟期。成熟能够排卵的鱼(包括雄鱼)用100微克剂量的式(Ⅱ)的十肽化合物进行一次处理。
尚不成熟而不能排卵的鱼应保持在自然产卵温度下，应每次注入5微克上述指定的化合物，至少注入2次，最多不超过10次，以卵细胞的细胞核从细胞中心移到边缘处为准。处理次数取决于与“排卵成熟”期相比，性产物的实际成熟期。成熟过程至少持续70日度，在极少情况下多达350日度，水温为8～14℃。
例6人工诱导繁殖白链(Hypophthalmichthys molitrix Val.)从该鱼的群体中选出性成熟鱼，将其运到繁殖场所。分离雄鱼和雌鱼。根据例1测定性产物的成熟期。成熟能排卵的鱼(包括雄性鱼)用100微克剂量的式Ⅲ的十肽化合物进行一次处理。
尚不成熟而不能排卵的鱼应保持在自然产卵的温度下，并应将上述化合物注入鱼体，每次剂量为10微克，至少注入二次，最多十次，以卵细胞中细胞核从细胞中心移到边缘处为准。处理次数取决于与“排卵成熟”期相比，性产物的实际成熟期。这个成熟过程至少持续150日度，在极少情况下达850日度，水温范围为20～26℃。
最后一剂注入240～260时度后，发生排卵，然后剥离性产物。
文中，式ⅠGlp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X3-Pro-X4式ⅡGlp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-NH2式ⅢGlp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Trp-Leu-Pro-Gly-NH2第一页第七段参见《鱼类性周期的神经激素调节的现状及生物技术在人工诱导繁殖鱼中激素影响的现状》，第8页，杰比尔斯基原著，1966年，列宁格勒，出版商Gos。大学。
权利要求
一项方法，在与鱼的自然产卵季节无关的期间内，从性成熟鱼中获取适于受精的性产物的方法。采用该方法，实际成熟期由探测性产物(卵子或精子)测定；将成熟鱼与尚未成熟而不能排卵的鱼分开；向鱼体注入具有激素作用的化合物；排卵之后，从该鱼体或其环境中获取性产物；该方法的特征是，通式(I)的九肽-C1-4烷基酰胺和十肽酰胺及其盐或其金属络合物为具有激素作用的化合物，焦谷氨酰-组氨酰-色氨酰-丝氨酰-酷氨酰-X1-X2-X3-脯氨酰-X4(I)其中，X1是甘氨酰基，或任何天然或合成氨基酸残基的D-异构体，X2表示在侧链上含1～4个碳原子的L-氨基酸残基，或L-苯基丙氨酰基，或L-色酰残基，X3表示侧链为含1～4个碳原子或侧链为含2～4个碳原子烷氧基-酰胺的L-氨基酸残基，X4是甘氨酸-酰胺或1～4个碳原子烷基-酰胺基，将这些化合物注入鱼体内，剂量为0.1微克至5毫克，2至500微克较好，最好为5至100微克；对于尚不成熟而不能排卵的鱼，上述剂量至少分为二份，至多分为十二份注入鱼体，其中最后一份剂量至少与其前一份相同或最好至少比前一份大1.5倍。
专利摘要
本发明叙述在与鱼的自然产卵季节无关的期间内，从性成熟鱼中获取适于受精的有性产物的方法。采用该方法，实际成熟期由探测性产物(卵子或精子)测定；将成熟鱼与尚未成熟而不能排卵的鱼分开；向鱼体注入具有激素作用的化合物；排卵之后，从该鱼体或其环境中获取性产物。按照本发明的方法，将九肽-C
文档编号A01K61/00GK85101294SQ85101294
公开日1987年1月24日 申请日期1985年4月1日
发明者汤姆斯, 安一克, 支瑞哥, 克瑞拉, 布拉兹, 一斯文 申请人:克兹波特导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan