专利名称:新抗生素制黄肝菌素的制备方法和农业园艺用杀菌剂的制作方法
本发明是关于新抗生素制黄肝菌素(Xanthostatin代号SR-44)和其制备方法，以及一种有效成份为制黄肝菌素的农业园艺用杀菌剂。
以往，农业园艺用杀菌剂一直是使用如铜、汞、砷之类重金属化合物制剂和有机氯、有机磷药剂。但是这些药剂对动物和人体都有害，对土壤有污染作用，并且残留在自然界中的有害物质又长期地作用于动、植物。这样造成的环境污染已成了当今重大的社会问题，从而导致了目前这种被禁止或限制使用的局面。此外，随着选择性药剂的减少及抗药菌的出现，各种植物病害-尤其是水稻的主要病害有明显加重的趋势。为此，人们迫切希望能开发出一些既有强选择性效果，又有高度安全性的新型农药。
本发明的目的在于提供一种对各种植物病害均有效的新抗生素及其制备方法。而且本发明的目的还在于提供一种以上述抗生素为有效成份的农业园艺用杀菌剂。
本发明所述的抗生素制黄肝菌素为未见文献报道的新抗生素，其具有后述的理化性质。同时，在后述的喷撒试验中，对水稻的主要病害如水稻纹枯病、稻瘟病及其它如黄瓜灰霉病、黄瓜炭疽病、茄黑斑病、葡萄晚腐病等各种植物病害都显示了出色的防治效果，并且既无任何药害，又对施用人员毫无影响，是一种优良的农业园艺用杀菌剂。
以下对本发明进行详细的说明。
抗生素制黄肝菌素的制备使用的微生物用来生产本发明所述的抗生素制黄肝菌素的微生物是一种属于链霉菌属的菌种，其具有生产抗生素制黄肝菌素的能力。
链霉菌SP·SR-44(Streptomyces SP·SR-44)(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心的保藏号CGMCC-0092)(以下简称为“SR-44菌株”)就是其中一例。该菌株在与本申请相应的日本专利申请中被命名为“链霉菌SP·RS-44。”该微生物具有上述特性，适于生产本发明所述的抗生素制黄肝菌素，因而能有效地使用于本发明所述的制备方法中。
同时，上述SR-44菌株的自然及其人工变异菌株也均属于链霉菌属的菌种。凡具有生产后述抗生素制黄肝菌素能力的微生物均可应用本发明所述的方法。
上述“SR-44菌株”是从中国江苏省的土壤中分离而得，其具有下述性质1.形态特征在用含有葡萄糖、酵母浸膏的菌体分析用培养基上培养本菌株“SR-44菌株”，然后进行菌体分离干燥，再用6N盐酸在110℃、加热水解20小时。用纸层析法检测细胞壁的氨基酸组分时，可以发现L、L-二氨基庚二酸。
此外，在琼脂平板上生长的气生菌丝呈现出螺旋状，可以看出这种螺旋状菌丝是由数十个孢子所组成。但是却看不到孢子囊和运动性的孢子。
从上可以说明，本菌株属于链霉菌属。孢子的形态呈圆柱状表面平滑。
2.在各种培养基上的生长状态(于27℃培养三周，颜色按照“颜色名称描述词典”(Descriptive color names dictionary)记述。
(1)蔗糖硝酸盐琼脂培养基生长 不生长(2)葡萄糖一天冬酰胺琼脂培养基生长 普通气生菌丝 微量 b灰乳色(oyster white)基内 b灰乳色(oyster white)色素 无(3)甘油一天冬酰胺琼脂培养基生长 普通气生菌丝 微量 b灰乳色(oyster white)基内 b灰乳色(oyster white)色素 无(4)淀粉-无机盐琼脂培养基生长 良好气生菌丝 多量 2ge柏氏色(Bergey)基内 2ie淡芥色(light mustard)色素 无(5)酪氨酸琼脂培养基生长 良好气生菌丝 多量 3dc自然色(natural)基内 2le芥色(mustard)色素 2ea亮黄色(light maize)(6)营养琼脂培养基生长 良好气生菌丝 无基内 1 1/2 Ca乳色(cream)色素 无(7)酵母-麦芽琼脂培养基生长 良好气生菌丝 多量 5fe灰色(ash)基内 2lg芥黄褐色(mustard tan)色素 无(8)麦片琼脂培养基生长 不良气生菌丝 无基内 不明色素 无(9)胨-酵母-铁琼脂培养基生长 良好气生菌丝 无基内 1 1/2 ea淡黄色(light yellow)色素 无3.碳源的利用性(普戈琼脂培养基)L-阿拉伯糖 -D-木糖 +D-葡萄糖 +D-果糖 -蔗糖 -肌醇 -
L-鼠李糖 -棉子糖 -D-甘露醇 -+……生长 -……不生长4.其它生理性质(1)合适温度 25～30℃(2)明胶的液化 液化(葡萄糖-胨-明胶培养基)(3)淀粉水解 水解(淀粉-无机盐琼脂培养基)(4)脱脂乳的凝固 凝固(5)脱脂乳的液化 液化(6)黑色素的生成(酪氨酸琼脂培养基) 不生成(胨-酵母铁琼脂培养基) 不生成具有上述各性质的链霉菌属菌种按柏氏细菌学鉴定手册第八版(Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology 8 th ed)分类法，本菌种应属于WISIC-ISM群，从色调、孢子形态来看，最近缘可可链霉菌。由此可以推断本菌种属可可链霉菌或其极近缘菌。
“SR-44菌株”的培养及制黄肝菌素的制取和提纯用链霉菌属的上述抗生素生产菌，通过常规的抗生素生产方法，可以培养“SR-44菌株”并制得本发明所述的抗生素制黄肝菌素。培养方式既可为液体培养也可为固体培养。但为了有利于工业性生产时的培养，宜将上述生产菌的孢子悬浮液或培养液接种到培养基上并进行通气搅拌培养。
对培养基中的营养源并无特殊的规定，可含有常用于微生物培养的碳源，氮源及其它营养源。其中碳源可为淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、肌醇、甘露醇等。氮源可为胨、大豆粉、肉膏、米糠、麦皮、尿素、玉米浆、铵盐、硝酸盐，以及其它有机或无机含氮化合物。对于其它营养源来讲，可适当添加一些无机盐类，例如食盐、磷酸盐类及钾、钙、锌、锰、铁之类的金属盐，必要时也可添加些动、植、矿物油等作为消泡剂。
对培养时的温度、时间等培养条件并无严格的限制，以适于使用菌的发育为准，并以选择制黄肝菌素产量最高的条件为好。例如，培养基的pH范围可为4～9，以接近中性为好。培养温度、搅拌条件等均应根据所使用菌株的种类及外部条件等进行适当的调节，以获得最好的效果。
由上述所得的培养物出发，通过一些适当的方法就能制得制黄肝菌素。这是些常用于提取代谢产物的常规方法。例如，可利用制黄肝菌素与不纯物在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行提取。具体地讲，制黄肝菌素大部分存在于培养滤液中。将培养液调整到偏酸性，譬如调整到PH4.0，再用醋酸乙酯之类的有机溶剂进行提取。所得的浓缩油状物通过吸附层析、硅胶层析、液相层析、离子交换层析、凝胶层析等组合精制后，即可得到含有制黄肝菌素及其它活性成分的组份。例如，将油状物进行硅胶层析后在氯仿-甲醇中展开得到活性组份。然后通过高速液相层析〔例如，充填剂选用Nucleosil5C18，展开剂为甲醇-水(8∶2)中加入1%的二乙胺-甲酸(pH7.5)〕取得粗粉。该粗粉经过高速液相色谱(如High-Carbcn ODS)的精制，即可制得白色粉末状的制黄肝菌素精制品。
如此所制取的新抗生素制黄肝菌素具有下述理化性质及生物性质。
抗生素制黄肝菌素的理化性质及生物性质分介点于160℃起徐徐分介元素分析碳63.36%、氢8.69%、氧26.72%比旋度〔α〕20D＝+3.4°(C＝1%、氯仿)紫外吸收光谱
210、250nm(Sh)(参照图1)红外吸收光谱(KBr法)3400、2900、1755、1695、1620、1445、1375、1240、1155、1085、970、900、715cm-1(参照图2)溶介性易溶于甲醇、丙酮、醋酸乙酯、氯仿、苯;难溶于水;不溶于正己烷、戊烷分子量(按FD质谱)766(分子式C41H66O13)显色反应与茴香醛-硫酸、2、4-二硝基苯肼呈阳性;与三氯化铁、茚满三酮、来登·史密斯试剂呈阴性反应物质颜色白色粉末薄层分析(美国Merck公司制薄层板0.25mm硅胶)溶剂为氯仿∶甲醇＝2∶1时 Rf值0.42溶剂为醋酸乙酯∶苯＝4∶1时 Rf值0.16抗菌谱采用通常的琼脂平板稀释法，以最低抑制浓度(MIC)来表示。细菌使用肉汤琼脂培养基，霉菌使用马铃薯蔗糖琼脂培养基。
MIC(mcg/ml)黄瓜灰霉病菌 125(Botrytis cinerea)黄瓜炭疽病 125(Colletotrichum lagenarium
水稻稻瘟病 125(pyricularia oryzae)抗丝核菌·茄镰孢菌 125(Rhizoctonia solani)黑曲霉菌 125(Aspergillus niger)格链孢菌 500(Alternaria mali)葡萄晚腐病菌 500(Glomerella cingurata)水稻黄单胞菌 32(Xanthomonas oryzae)柑桔黄单胞菌 32(Xanthomonas citri)金色葡萄球菌 ＞500(Staphylococcus aureus)大肠埃希氏菌BE1186 ＞500(Escherichia coli BE1186)枯草杆菌 ＞500(Bacillus subtilis)紫外光谱中，在240nm(肩峰)处有吸收峰的抗生素能例举出包扎霉素(Bandamycin)、查耳霉素(Chalcomycin)、中性霉素(Neutramycin)等。但它们的分子量分别为500、600、513，而且分子式也各不相同。因此可以判断本发明所述的制黄肝菌素是一种与上述物质有着明显不同的新抗生素。
有效成份为制黄肝菌素的农业园艺用杀菌剂本发明所述的有效成份用作农业园艺用杀菌剂时，可同样使用该技术领域：
中已知农药所通用的固相载体，液相载体及乳化分散剂等制剂，并能配制成颗粒剂、粉剂、乳化剂、可湿性粉剂、片剂、油剂、喷雾剂等任意的剂型。这些载体中固相载体可以是粘土、高岭土、皂土、酸性白土、硅藻土、碳酸钙、硝化纤维素、淀粉、阿拉伯胶等;液相载体可以是甲醇、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、乙二醇等。同时，在制剂中一般可适当添加些辅助剂，如高级醇的硫酸酯、聚氧化乙烯、烷基烯丙基醚、烷基烯丙基聚乙二醇醚、烷基烯丙基无水山梨糖醇月桂酸酯、烷基烯丙基磺酸盐、季胺盐、聚烯化氧等。
一般而言，各制剂中有效成份的配比，在乳剂及可湿性粉剂中为10～90%;在粉剂及油剂中为0.1～10%。当然，也可根据不同的使用目的而适当增减。
本发明的制剂还可与其它杀菌剂、除草剂、杀虫剂、肥料物质、土壤改良剂等配合使用。
以下就本发明的制造、实施、试验事例作具体的说明，但这并不意味着对本发明有所限定。
其中〔%〕、〔比〕分别表示重量%、重量比。
制造例以葡萄糖2%、可溶性淀粉1%、肉汁浸膏0.1%、干酵母0.4%、大豆粉2.5%、食盐0.2%、磷酸二氢钾0.005%的配比制成培养基，将上述“SR-44菌株”接种于该培养基中，置于28℃振荡培养96小时。取其培养滤液36升，于pH＝4的条件下用醋酸乙酯进行抽提。提取液经减压浓缩后，即得4.8g油状物。然后以氯仿-甲醇(2∶1)为溶剂，调制一根直径为55mm、长度为700mm的硅胶柱，并将试料溶于甲醇后在柱中展开。以每10ml为一计量，在NO101～140的区域里收集活性组份。
将上述活性组份的收集物减压浓缩，得到1.0g浓缩物。此后，用高速液相色谱进行分离制取制黄肝菌素的精制品。色谱柱可选用核苷5C18，直径为20mm，长度为30cm。溶剂采用甲醇-水(8∶2)，并添加1%的二乙胺·甲酸(pH＝7.5)。流速为8.0ml/分，压力为170Kg/cm2，在展开时间为20分钟时出现制黄肝菌素。收集制黄肝菌素的组分，用0.1N盐酸调整到pH4，减压浓缩直至除尽甲醇为止。用醋酸乙酯抽提、水洗、浓缩，最后得到100mg制黄肝菌素的粉末。
然后，再用高速液相色谱进行精制。色谱柱为High-Carbon ODS直径10mm，柱长25cm，溶剂为甲醇-水-1%二乙胺。甲酸(pH7.0)(8∶1∶1)，流速1.4毫升/分，压力150Kg/cm2，在展开时间为23分钟时出现制黄肝菌素。收集制黄肝菌素的组分，用0.1N盐酸调整到pH4，减压浓缩直至除尽甲醇为止。用醋酸乙酯抽提，以0.1N盐酸洗涤，再水洗、浓缩、冷冻干燥，可得40mg制黄肝菌素的白色粉末状纯品。
实施例1 可湿性粉剂将10份制黄肝菌素与5份十二烷基磺酸钠，2份二苯甲烷-二磺酸钠-甲醛聚合物及83份陶土混合，粉碎，即得100份制剂。
实施例2 乳剂将8份制黄肝菌素与10份乙二醇、20份二甲基甲酰胺、10份烷基、二甲基苄基氯化铵及52份甲醇混合溶解，即得到100份乳剂。
实施例3 粉剂将0.2份制黄肝菌素与0.5份硬脂酸钙、50份滑石粉及49.3份陶土混合、粉碎，即得100份粉剂。
实施例4 颗粒剂将10份制黄肝菌素与15份淀粉、72份皂土粉及3份十二烷基硫酸钠混合、粉碎，即得100份制剂。
试验例1对黄瓜灰霉病的防治试验将按实施例1所制成的可湿性粉剂稀释至所定的浓度，然后喷洒到播种后生育15天的黄瓜(品种相横半白)幼苗上，并进行风干。
将黄瓜灰霉病菌(Botorytis cinerea)置于土豆、葡萄糖琼脂培养基上培养，用BLB光进行照射使孢子诱发。将诱发后的孢子悬浮于10%葡萄糖和1%的酵母抽提溶液中。
药液干燥后，将黄瓜移至接种箱，将上述悬浮液用喷雾器进行喷雾接种，每10棵黄瓜幼苗约喷药10cc。
接种后的黄瓜苗置于恒温多湿的地方，4天后检查发病的情况。
防治效果按下述方法进行计算发病指数 发病程度0 不发病1 仅有病斑2 发病面积占10%以下3 发病面积占10%以上至20%以下4 发病面积占20%以上至30%以下5 发病面积占30%以上至40%以下6 发病面积占40%以上防治效果(%)＝(1- (处理区发病指数总和)/(对照区发病指数总和) )×100
其结果如表1所示表1试验化合物 喷洒浓度(ppm) 防治效果(%) 药害制黄肝菌素 50 95 无25 91 无12.5 91 无6.25 91 无对照处理 - 0 -本发明的效果根据以上试验的结果可以证明，本发明所述的农业园艺用杀菌剂，提供了一种新的杀菌剂。这种杀菌剂在低浓度下对植物病害也具有极高的防治效果，而且具有高度的安全性并无任何药害。
附图的说明图1为本发明所述的抗生素制黄肝菌素的紫外吸收光谱图。图2为抗生素制黄肝菌素的红外吸收光谱图。
权利要求
1.一种新抗生素制黄肝菌素的制备方法，其特征在于培养属于链霉菌(Streptomyces)属的抗生素制黄肝菌素的生产菌，再从这些培养物中分离提取新抗生素制黄肝菌素。
2.按权利要求
1所述的制备方法，其特征在于所述的抗生素制黄肝菌素的生产菌为链霉菌SP·SR-44(Streptomyces SP·SR-44)。
3.一种农业园艺用杀菌剂，其特征在于所含的有效成份为新抗生素制黄肝菌素。
专利摘要
本发明提供了一种新抗生素制黄肝菌素及其制备方法，还提供了有效成分为制黄肝菌素的农业园艺用杀菌剂。它既有强选择性，又有高度安全性，对施用人员毫无影响，并且无任何药害。本抗生素通过培养链霉菌SP·SR-44(Streptomyces SP·SR-44)而制得。
文档编号A01N63/02GK86100575SQ86100575
公开日1987年11月18日 申请日期1986年5月10日
发明者成杏春, 矶野清, 梁风群, 山口勇, 方仁萍, 黄耿堂, 周钰, 木原刚, 沈寅初, 日下部宽男, 朱道荃, 见里朝正 申请人:上海市农药研究所, 日本理化学研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan