棉花纤维转录因子的制作方法

专利名称：棉花纤维转录因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用体外构建的DNA转录或表达盒的方法，此转录或表达盒能够指导植物中感兴趣的DNA序列在纤维组织中转录以产生表型改变的纤维细胞，且本发明还涉及提供或修饰棉花纤维的各种性状的方法。本发明以使用改变棉花纤维表型的棉花纤维启动子的方法和由此方法产生的棉花纤维为例作了阐述。
背景一般来说，遗传工程技术用来修饰个体原核和真核细胞的表型，尤其是培养细胞。已经证明植物细胞比其它真核细胞更难于修饰，这不仅是因为缺少适当的载体系统，也是因为包括不同目标的结果。在很多应用中，期望能够控制基因在一种植物的特定生长阶段或在特定的植物组织中表达。为了这个目的，需要在适当的细胞类型和/或在植物发育的适当阶段能够提供期望的转录起始，且对植物的发育和生产没有严重损害影响的调控序列。因此能够分离可以用于在宿主植物的生长循环中在植物细胞中提供期望的转录调节的序列是所感兴趣的问题。
这个问题的一个方面是改变特定细胞类型的表型的能力，以提供改变性状或改进性状的成熟细胞类型，诸如起源于纤维组织的分化的表皮细胞，例如棉花纤维细胞。棉花是一种具有极大商业价值的植物。棉花纤维除了可以用于生产纺织品外，棉花的其它用途包括用棉籽油制备食品和用棉籽皮作动物饲料。
尽管棉花作为一种作物非常重要，但棉花纤维表型的育种和遗传工程却以相对较慢的速度进行着，这种因为缺乏可用于选择性地有效改变纤维表型的可靠的启动子。为了实现期望的表型改变，需要能够在处于发育中的纤维细胞中起始转录的转录起始区。因此，棉花生物工程研究的一个重要目标是获得允许一个蛋白在棉花纤维中选择性表达，以影响诸如纤维强度，长度，颜色和着色能力的性质的可靠的启动子。
相关文献在PCT出版物WO 94/12014和WO95/08914和John and Crow，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院报)，895769-5773，1992中讨论了棉花纤维特异性启动子。已经分离到了在棉花纤维中优先表达的多个互补DNA克隆。所分离到的克隆中的一个是与在原生细胞壁晚期和次生细胞壁早期合成阶段含量最高的信使RNA(mRNA)和蛋白相对应的。John and Crow，见上。
在动物中，ras总族被细分为涉及控制细胞生长和分裂的亚族ras，控制分泌过程的rab/YPT成员，和涉及控制细胞骨架结构的rho(Bourne et al.，(1991)Nature 349117-127)，并且现在在植物中已鉴定出了数个类似基因(综述参见Terryn et al.，(1993)Plant Mol.Biol.22143-152)。所发现的植物基因没有一个属于重要的ras亚族，除了一个以外，所有的鉴定出的基因都属于rab/YPT1亚族，只有一篇最近报道在豌豆中克隆了rho基因(Yang and Watson(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908732-8736)。
研究植物中这些基因的功能的工作很少，一篇最近的报道显示来源于拟南芥菜的一个小的G-蛋白可以在功能上互补涉及囊泡运输的酵母的突变形式，提示此植物基因具有相似的功能(Bednarek et al.，(1994)Plant Physiol 104591-596)。
在动物中，称为Rac和Rho的亚族rho的两个成员已经被发现涉及肌动蛋白组织构成的调节(综述文献参见Downward，(1992)Nature 359273-274)。
已经发现Rac1通过影响质膜上的微丝排列介导生长因子诱导的膜扰动(Ridley et al，(1992)Cell 70401-410)，而RhoA调节与聚焦粘连相关的肌动蛋白应激纤维的形成(Ridley and Hall，(1992)Cell 70389-399)。
在酵母中，CDC42基因编码一个rho类型的蛋白，它也调节涉及细胞极性建立的肌动蛋白组织构成，细胞极性的建立是在酵母芽痕中定位沉积几丁质所必需的(Adams，et al.，(1990)J Cell Biol 111131-143)。
不管是用酵母CDC42温敏突变体通过温度迁移(Adams et al.，1990)，或是通过将显示显性阴性表型的突变体Rac和Rho蛋白显微注射到成纤维细胞(Ridley et al.，1992；Ridley and Hall，1992)使基因功能被破坏，均将导致肌动蛋白网的解体。
在植物中，尽管细胞骨架的组织构成在细胞分裂，延伸，和随后的次生细胞壁多聚物沉积的模式调节中非常重要，但对细胞骨架的组织构成的控制还所知甚少。棉花纤维是完美的研究细胞骨架组织构成的系统。棉花纤维是单一的细胞，其中细胞的延长和次生细胞壁沉积可以作为独立事件加以研究。这些纤维在棉铃中随着花开期同步发育，且每个纤维细胞延长大约3个星期并沉积一层薄的原生细胞壁(Meinert and Delmer，(1984)Plant Physiol.591088-1097；Basra andMalik，(1984)Int Rev of Cytol 8965-113)。在向次生细胞壁纤维素合成转移时，纤维细胞以皮层微管和细胞壁微纤丝排列的模式经历一个同步的转移，即可以通过肌动蛋白的组构来调节上游的事件(Seagull，(1990)Protoplasma 15944-59；和(1992)InProceedings of the CottonFiber Cellulose Conference，National Cotton Council of America，Memphis RN.pp 171-192)。
在Umbeck的美国专利号5,004,863和5,159,135中描述了土壤杆菌介导的棉花转化，且在1992年9月17日出版的WO92/15675中报道了用微粒轰击法的棉花转化。Radke等(Theor.Appl.Genet.(1988)75685-694；Plant Cell Reports(1992)11499-505)描述了芸苔属植物的转化。
本发明概述本发明描述了新的DNA构建体和它们的使用方法，这些DNA构建体可以指导棉花纤维中所感兴趣的基因的转录，尤其是在纤维发育的早期和在次生细胞壁发育时期。这些新的构建体包括一个包括从在棉花纤维表达的基因中获得的转录和翻译起始区的载体，和使用包括所述载体的构建体改变纤维表型的方法。内源的3’区和5’区在指导有效的转录和翻译中可能都是很重要的。
从涉及棉花纤维发育调节的基因中得到了三个启动子。其中一个，Rac13来源于棉花中的一个编码动物Rac蛋白同源类似物的蛋白。Rac13在纤维发育中显示高度增强的表达。这种表达模式与细胞骨架的重新组织时间表相关良好，提示Rac13棉花基因可能象动物中的Rac蛋白一样，参与细胞骨架组织构成的信号传导途径。Rac13是一个在纤维发育中中度表达的基因，在花开期后9天时开始表达并在花开期后约24天时停止表达。它在花开期后17至21天发育纤维之间时的表达达到最高。
另外一个棉花蛋白的启动子命名为4-4。4-4信使RNA在花开期后17天在纤维细胞中积累并延续到纤维成熟，纤维成熟发生在花开期后约60天。数据显示4-4启动子在花开期后第35天仍保持非常活跃。
另外一个提供的启动子来源于一个脂转运蛋白(此后有时用“Ltp”表示)，此蛋白在棉花发育中优先表达。
本发明的方法包括用包括棉花纤维启动子的转录或表达构建体转染所感兴趣的宿主植物细胞，并产生可以生长以生产具有期望表型的纤维的植株。因此本发明的构建体和方法可以用于内源纤维产物的调节和内源产物的产生，也可以用于修饰纤维和纤维产物的表型。这些构建体还可以用作分子探针。本文特别地考虑了用于棉花胚胎组织中的基因表达的构建体和方法。用这些方法可以获得新的棉花植株和棉花植株的一部分，诸如修饰的棉花纤维。
本发明还提供了与修饰棉花纤维中的颜色表型有关的构建体和使用方法。这些构建体包含涉及色素化合物产生的基因的表达序列，诸如花色素苷，黑色素或靛蓝，这些构建体还可以包含将基因产物导向到植物细胞的特定位置的序列，诸如质体细胞器，或液泡。质体导向在涉及芳香氨基酸生物合成途径的基因的表达中有特殊用途，而液泡导向在色素合成所需要的前体存在于液泡中时有特殊用途。
尤其感兴趣的是生产有色纤维的植株，即具有在纤维发育阶段由植株在纤维中产生的色素。与用分离的加工过程进行收获并染色或其它着色处理的那些纤维相反。从产生这些有颜色纤维的植株中获得的纤维可以用于生产不需要进行任何染色处理的有颜色的纱线和/或织物。尽管天然着色的棉花可以从各种驯化的和野生的棉花品种中获得，但本发明提供的棉花纤维具有的颜色是由一种进行遗传工程操作的蛋白的表达而产生的。
因此，本发明提供了涉及棉花纤维颜色表型修饰的构建体和使用方法。这些构建体包含参与色素化合物产生的基因的表达序列，诸如花色素苷，黑色素或靛蓝，这些构建体还包含将基因产物导向到植物细胞的特定位置的序列，诸如质体细胞器，或液泡。质体导向在涉及芳香氨基酸生物合成途径的基因的表达中有特殊用途，而液泡导向在色素合成所需要的前体存在于液泡中时有特殊用途。
附图的描述


图1显示编码来源于4-4互补DNA的结构蛋白的DNA序列。
图2显示用来源于4-4-6基因组克隆的基因组DNA构建的启动子构建体pCGN5606的序列。
图3显示4-4启动子构建体pCGN5610的序列。
图4显示编码在棉花纤维中表达的Rac13基因的互补DNA序列。
图5显示rac13基因的启动子区的序列。
图6显示pCGN4735的限制性图谱。
图7显示棉花纤维特异性脂转运蛋白基因的Ltp启动子区的序列。
图8显示用于植株转化的双向载体pCGN5148和pCGN5616的排列，相应地用于表达黑色素合成和靛蓝合成的基因。
图9提供用于用颜色构建体转化的对照棉花Coker130的纤维的颜色测量结果。
图10显示为了表达黑色素合成基因而用pCGN5148构建体转化的植物的颜色的测量结果。
图11显示为了表达黑色素合成基因而用pCGN5149构建体转化的植物的颜色的测量结果。
图12显示为了表达靛蓝合成基因而用构建体pCGN5616转化的植物的颜色的测量结果。
图13显示由非转基因的有颜色棉花植株产生的天然有色棉花植株的对照测量结果。
本发明的详细描述根据本发明，描述了可以用于使所感兴趣的核苷酸序列在植物宿主细胞中转录、尤其是在棉花纤维细胞中转录以产生具有改变的颜色表型的棉花纤维的新的构建体和方法。
棉花纤维是胚珠的外层珠被的分化的单个表皮细胞。它有四个明显的生长期起始，延长(原生细胞壁合成)，次生细胞壁合成，和成熟。纤维发育的起始可能是由激素启动的。在延长期合成原生细胞壁，持续至花开期后(DPA)25天。次生细胞壁的合成开始于延长期终止之前并持续至约40DPA，形成一个几乎完全是纤维素的细胞壁。
在这些细胞中所用的构建体依据使用构建体的目的可以包括几种形式，因此，这些构建体包括载体，转录盒，表达盒和质粒。转录和翻译起始区(有时也称为“启动子”)，最好包括一个转录起始调控区和5’非翻译区的一个翻译起始调控区，即“核糖体结合位点”，它负责将信使RNA结合到核糖体上和翻译起始。所有的起始控制区的转录和翻译功能元件最好是可从相同的基因中获得或衍生而来。在一些实施方案中，将通过加入诸如增强子的序列，或删除非必要和/或非期望序列修饰此启动子。“可获得的”，是指具有与天然启动子的DNA序列足够相似的DNA序列的启动子将被计划用来提供所感兴趣的DNA序列的转录的期望特性。它包括天然的和合成的序列，和合成序列与天然序列联合使用的序列。
被选中用于棉花纤维修饰的棉花纤维转录起始区可以包括本发明提供的4-4，rac13和Ltp棉花纤维启动子区。
用于在棉花纤维中转录某个所感兴趣的核苷酸序列的转录盒在转录方向上包括棉花纤维转录起始区，感兴趣的DNA序列，和在植物细胞中起作用的转录终止区。当此转录盒提供感兴趣的DNA序列的转录和翻译时，可以将其认作一个表达盒。也可以存在一个或多个内含子。
也可以存在其它序列，包括那些必需的编码跨膜肽和分泌前导序列的序列。
本发明的纤维组织转录起始区最好是在其它植物组织中不能稳定检测到的，除此之外，能够在其它植物组织和/或纤维发育的其它阶段启动转录的转录起始区是可以接受的，只要这些区域在处于所感兴趣的特定阶段的棉花纤维中提供显著的表达水平，且在整体上对植物不产生副作用干涉，尤其是不影响纤维和/或与纤维相关的部分的发育即可。
在棉花纤维转录/翻译起始控制区的下游并在调节控制下的是所感兴趣的核苷酸序列，它提供纤维表型的修饰。此核苷酸序列可以是编码感兴趣的多肽例如一种酶的任何开放阅读框架，或一个与基因组序列互补的序列，其中的基因组序列可以是一个开放阅读框架，一个内含子，一个非编码的前导序列，或任何其它的其互补序列抑制转录，信使RNA加工(例如剪接)，或翻译的序列。本发明的核苷酸序列可以是合成的，天然衍生的，或上述二者的组合。根据所感兴趣的DNA序列的性质，可能需要合成具有植物优选密码子的序列。植物优选密码子可以根据在所感兴趣的特定植物种类中最大量表达的蛋白中的出现频率最高的密码子来决定。表型的修饰可以通过调节内源转录或翻译产物或外源转录或翻译产物的产生来达到，如调节内源转录或翻译产物的量，相对分布等等，或调节外源转录或翻译产物的产量以在转基因宿主细胞或组织中提供新的功能或产物，特别感兴趣的是编码与植物纤维发育有关的表达产物的DNA序列，包括涉及细胞分裂素，生长素，乙烯，脱落酸等物质新陈代谢的基因。调节细胞分裂素表达的方法和组合物在美国专利No.5,177,307中有描述，本文作为参考文献列出。另外还可以使用来源于其它的真核或原核细胞的各种各样的基因，包括细菌和哺乳动物，细菌如那些根癌农杆菌T-DNA生长素和细胞分裂素的生物合成基因产物的基因，哺乳动物如干扰素的基因。
其它的表型修饰包括棉花纤维颜色的修饰。感兴趣的是涉及黑色素产生的基因和涉及靛蓝产生的基因。黑色素是在动物，植物和微生物中发现的深棕色的色素，任何一种来源的黑色素基因都可以用作插入本发明的构建体的序列来源。具体的例子包括可以从链霉菌抗生链霉菌中克隆的酪氨酸酶基因。在抗生链霉菌中ORF438编码的蛋白对黑色素的产生也是必需的，并且可能具有铜供体的功能。另外，可以从任何产生黑色素的生物中分离酪氨酸酶基因。此基因可以从人的头发，黑素细胞或黑素瘤，墨鱼和红公鸡等中分离。参见，例如欧洲专利申请No.89118346.9，它披露了一个在微生物中产生黑色素，其前体和衍生物的方法。另外，参见Bernan et al.Gene(1985)37101-110；和della-Cioppa et al. Bio/Technology(1990)8634-638。
靛蓝可以通过使用编码单加氧酶的基因来获得，例如将甲苯和二甲苯氧化成(甲基)苯乙醇并将吲哚转化成靛蓝的二甲苯加氧酶。在1990年5月7日出版的未审查的日本专利申请平2-119777中描述了二甲苯加氧酶基因的克隆和核苷酸与氨基酸序列。还可以使用可以将吲哚转化成靛蓝的诸如萘双加氧酶的双加氧酶；在Science(1983)222167中描述了萘双加氧酶基因nahA。假单孢菌Pseudomonas putida中编码萘双加氧酶的基因的克隆和其核苷酸序列分析参见Kurkelaet al.Gene(1988)73355-362。色氨酸酶基因序列可以与一个单加氧酶联合使用以增加用于转化成靛蓝的原料吲哚的数量。色氨酸酶基因序列的来源包括大肠杆菌(参见，例如，Deeley et al.(1982)J.Bacteriol.151942-951)。
质体导向序列(转运肽)可以从大量的诸如二磷酸核酮糖羧化酶的小亚基(SSU)植物细胞核编码的质体蛋白的基因，包括酰基载体蛋白(ACP)，十八烷醇-ACP脱氢酶，β-酮脂酰基-ACP合成酶和酰基-ACP硫酯酶的植物脂肪酸生物合成相关基因，或LHCPII基因。提供向质体运输功能的转运肽的编码序列可以包括某特定转运肽编码序列的全部或一部分，还可以包含与某特定转运肽相关的成熟蛋白编码序列的一部分。可以用于将目标蛋白转移到质体细胞器的转运肽的例子很多。只要能向质体运输，对本发明所用的具体的转运肽编码序列没有特殊要求。
作为使用转运肽将色素合成蛋白导向到质体细胞器中的方法之一，可以使用所需要的构建体直接转化质体基因组。在这个例子中，需要能够在植物质体中提供基因的转录的启动子。尤其有用的是使用T7启动子以提供高水平的转录。因为质体中不含适合从T7启动子转录的聚合酶，可以从一个细胞核构建体表达T7聚合酶并使用上面描述的转运肽将其导向到质体上(参见McBride et al.(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.917301-7305；还可参见1995年6月6日申请的系列号为08/472,719的题为“植物质体中转基因构建体的控制表达”的未决美国专利申请，和1993年12月14日申请的未决美国专利申请SN08/167/638和1994年12月12日申请的PCT/US94/14574)。为了将T7聚合酶表达限制在适当的组织或适当的发育阶段，组织特异性的或受发育调节的启动子对表达是很有用的。
将黑色素合成基因导向到液泡上对积累涉及黑色素在液泡中合成的酪氨酸底物的植物组织也是很有用的。导向到液泡上的蛋白信号可以从一个植物基因获得，此植物基因表达产物可以正常地通过粗面型内质网运输，诸如来源于番茄的金属羧肽酶抑制剂基因的32个氨基酸的N-末端区(Martineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.228281-286)。除了此信号序列外，液泡导向构建体还编码位于所编码蛋白的羧基末端的液泡定位信号(VLS)。可以从各种其它的植物基因中获得适当的信号序列和VLS区，且可以相似地用于本发明的构建体。正如Chrispeels et al.，Cell(1992)68613-616中综述的那样，大量的液泡导向多肽是本领域所公知的。
编码花色素苷色素合成途径中的二氢黄酮醇还原酶的玉米Al基因就是这样一种酶。在表达Al基因的细胞中，dihydrokempferol被转变成2-8烷基无色花葵素，通过内源的植物酶作用可进一步代谢成花葵素色素。其它的花色素苷或黄酮醇类的色素对棉花细胞纤维的修饰也有用处，并已被建议用于植物花朵(有关植物花朵颜色的综述参见van Tunen et al.，Plant Biotechnology Series，Volume 2(1990)Developmental Regulation of Plant Gene Expression，D.Grierson ed.)。花色素苷由细胞内的苯丙氨酸库经几个步骤产生。R和C1是玉米调节蛋白，这些蛋白的激活是由从这些库开始的花色素苷生物合成中的正反馈作用影响上游步骤来完成的。Perot and Cone(1989)Nucl.AcidsRes.，178003中描述了R基因，并在Paz-Ares et al(1987)EMBO，63553-3558中描述了C1基因。Lloyd et al.(1992)Science，2581772-1775中讨论了这两个基因。
虽然有商业价值的棉花种植品种的纤维在颜色上主要是白色的，但其它自然发生的棉花种类具有棕色的或红棕色的纤维。另外，已经鉴定出了一个含有绿色纤维的棉花品系。提供这种纤维的棉花品系可以从各种来源获得，包括BC品种棉(BC Cotton Inc.，Box 8656，Bakersfield，CA 93389)和Fox Fibre棉(Natural Cotton Colors，Inc.，P.O.Box 79l，Wasco，CA 93280)。
这些有色棉花品系的存在提示花色素苷色素合成途径中所需要的前体在棉花纤维细胞中是存在的，因此可以进一步进行颜色表型的修饰。因此，玉米R和C1基因可以用于增强在纤维细胞中产生的花色素苷的水平。因为R和C1蛋白是在花色素苷色素前体生物合成的调节水平具有正调控作用的蛋白，这些蛋白是在细胞核中表达，而不是导向在质体或液泡上。
对一些应用情形来说，修饰纤维的其它方面是有用的。例如，修饰诸如纤维的强度或结构的棉花纤维的各方面是有用的。因此，可以在本发明的构建体中插入适当的基因，包括PHB生物合成途径的基因(参见Peoples et al.J.Biol.Chem.(1989)26415298-15303和Ibid.15293-15397；Sexena，Plant Molecular Biology(1990)15673-683，这篇文献披露了纤维素合成酶催化亚基基因的克隆和序列分析；和Bowen et al.PNAS(1992)89519-523，此文献披露了啤酒酵母和Canadida albicans的几丁质合成酶基因)。在1995年2月2日申请的系列号为SN 08/397,652的题为“用卵巢组织转录因子进行棉花修饰”的未决美国专利申请中披露了使用激素有效改变纤维性质的各种构建体和方法，本文作为参考文献。
转录盒可以在当需要反义序列转录时使用。当需要多肽表达时，将使用用于所感兴趣的DNA序列的转录和翻译的表达盒。各种变化是有用的；这些变化可以包括对特定糖类，激素，酶，或其它生物学参数的形成的调节(增加或降低)。这些变化还包括修饰最终纤维的组合物，即改变水，固形物，纤维或糖类的比率和/或数量。其它可以修饰的所感兴趣的表型性质包括对应力，生物体，除草剂，修剪，生长调节剂等的反应。这些结果可以通过使一个或多个内源产物，尤其是酶或辅酶的表达还原来获得，内源产物表达的还原或是通过产生一个与天然基因的转录产物互补的(反义)转录产物，以抑制转录产物的成熟和/或表达，或是通过使一个内源的或外源的与植物纤维的发育相关的基因表达来进行。
表达盒中所用的终止区将主要是相对方便的一个，因为终止区看来是可以相互交换的。终止区可以是天然具有转录起始区，可以是天然具有所感兴趣的DNA序列，可以是从另外一个来源衍生而来的。终止区可以是天然发生的，或全部或部分合成的。方便的终止区可以从根癌农杆菌的Ti-质粒中获得，诸如章鱼碱合成酶和烟碱合成酶的终止区。在一些实施方案中，可能需要使用天然的在特定构建体中使用的棉花纤维转录起始区的3’终止区。
如本文所描述的一样，在一些例子中，在本发明的构建体中将存在附加的核苷酸序列以使某具体的基因产物导向到细胞的特定位置。例如，在将芳香有色色素合成的编码序列，尤其是那些以诸如酪氨酸和吲哚的芳香化合物作为其底物的酶的编码序列，用于一个构建体中时，最好包括可以将酶转运到质体的序列，如SSU转运肽序列。还有，对以酪氨酸为原料的色素的合成来说，如黑色素，导向到液泡上可以提供增强的颜色修饰。
以黑色素的产生来说，在棉花纤维细胞中提供来源于抗生链霉菌的酪氨酸酶和ORF438基因(Berman et al.(1985)37101-110)以从4-4和Rac13启动子开始进行表达。在链霉菌中，ORF438和酪氨酸酶蛋白是从相同的启动子区开始表达的。对在一个转基因植物基因组中构建体的表达来说，编码区可以在分离的启动子区的调节控制之下。两个基因的启动子区可以是相同的或不相同的。另外，两个基因从一个单一的植物启动子开始的协同表达也是需要的。在下面的例子中，详细描述了从4-4和rac启动子区开始表达酪氨酸酶和ORF438基因产物的构建体。也可能需要另外的启动子，例如，诸如CaMV 35S的植物病毒启动子可以用于一个期望的基因产物与其它的在棉花纤维组织中从4-4和rac启动子表达的基因产物的基本表达。
同样地，在某些应用情况中，其它的基本启动子也是有用的，例如mas，Mac或DoubleMac，美国专利No.5,106,739中描述的启动子和Comai et al.，Plant Mol.Biol.(1990)15373-381中描述的启动子。当需要包括多个基因构建体的植株时，例如表达黑色素基因，ORF438和酪氨酸酶的植株，可以通过用两个构建体进行共转化获得植株，或通过用单个构建体转化后采用植物育种方法以获得表达两个期望基因的植株。
将构建体导入某植物细胞宿主可以用很多技术且这些技术都是本领域熟练技术人员所公知的。这些技术包括使用根癌农杆菌或生根农杆菌作转染介质用DNA进行转染，原生质体融合，注射，电穿孔，粒子加速等等。对用农杆菌进行转化来说，可以在含有与Ti质粒，尤其是T-DNA相似的DNA的大肠杆菌中制备质粒。此质粒可能可以或不可以在农杆菌中复制，也即其可以具有或不具有如pRK290具有的广泛的原核复制体系，这一点部分取决于转录盒是否将整合至Ti质粒中或以独立质粒形式存在。农杆菌宿主将包含一个具有T-DNA转移到植物细胞所必需的vir基因的质粒和可能具有或不具有完整的T-DNA。至少Ti或Ri质粒的T-DNA的右边界，经常是左右两边界将参与转录构建体的侧面区域。使用T-DNA进行植物细胞的转化已经得到深入的研究并在欧洲专利申请120,516；Hoekema，双向植物载体-drukkerij，Kanters B.V.，Alblasserdam，1985，第5章；Knauf等，通过农杆菌的宿主范围表达的分析，细菌-植物相互作用的分子遗传学，Puhler，A.编辑，Springer-Verlag，NY，1983，p.245和An等，EMBO J.(1985)4277-284中有充分地描述。
为了感染，可以用颗粒加速和电穿孔法将缺乏T-DNA中发现的肿瘤基因的Ti质粒导入植物细胞。用辅助质粒的方法可以将构建体导入根癌农杆菌且所获得的已转染的生物体可以用于转染植物细胞；外植体可以与转化的根癌农杆菌或生根农杆菌一起培养以将转录盒导入植物细胞。另外，为了增强与植物基因组的整合，可以与一个转座酶联合使用将转座子的末端重复序列用作边界。在这种情况下，转座酶的表达应该是可以诱导的，这样一旦转录构建体整合进基因组就应该是相对稳定的整合。然后将转基因的植物细胞置于适当的选择性培养基中以筛选转基因的细胞，然后生长成愈伤组织，分化茎尖并在生根培养基上生长以产生小植株。
为了确定转基因细胞和植株中所转基因的存在，可以用本领域熟练技术人员所公知的方法进行Southern杂交分析。所转基因表达产物的检测可以依据产物的性质用任何一种方法进行，包括免疫分析，酶分析或目测检查，例如检测适当的植物组织或细胞中的色素形成。一旦获得了转基因植株，就可以进行培育以生产具有期望表型的纤维。可以收获纤维和/或收集种子。这些种子可以用作培育具有期望特性的其它植株的来源。术语转基因植株和转基因细胞包括转基因植株或转基因细胞来源的植株和细胞。
本文提供的各种序列可以用作分子探针以分离可能对本发明有用的其它序列，例如，从相同的或不同的来源的植物中获得相关的转录起始区。用此探针可以从本发明提供的序列获得的相关转录起始区将显示至少约60％的同源性，更优选的转录起始区将显示更高百分比的同源性。更为重要的是获得具有本文描述的时间和组织参数的相关的转录起始控制区。例如，使用探针4-4和rac，鉴定出了至少7个其它的克隆，只是没有进一步的分析。因此，通过本发明描述的技术和其它本领域所公知的技术(如Maniatis，et al.，Molecular Cloning，-A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor，New York)1982)，可以测定其它的能够如本发明所描述的那样指导棉花纤维转录的转录起始区。这些构建体还可以与植物再生系统联合使用以获得植物细胞和植株；因此，这些构建体可以用于修饰纤维细胞的表型，这些遗传工程操作的结果是产生被着色为此前没有得到的色度和/或强度的棉花纤维。
各种各样的棉花品种和品系可以用于本发明描述的方法。培育的棉花品种包括在西半球进化的Gossypium hirsutum和G.babadense(超长稳定，或Pima棉)，和东半球作物G.herbaceum和G.arboreum
通过使用比色计可以测定颜色表型，比色计是一种已经用于棉花样品的颜色客观测量的仪器。比色计使用各种光源和滤色器以获得样品颜色的不同评估值，有时称作三刺激值。
过去，这些评估值被用于计算可以指示棉花样品的黄颜色程度的值(Hunter’s+b，下面有描述)。黄颜色程度和反射度(来自Rd，样品的亮度和暗度)被用于棉花颜色测量以进行分级。典型的测试方法是通过将样品的表面暴露于可控光源来进行的。显示官方分级标准与Rd和+b测量值关系的典型颜色表显示于Cotton，RJ Kohel and CFLewis，Editors #24 in AGRONOMY Series-American Soc.Agromony(参见
图12-6)。
所以，各种比色计方法可以用于将颜色定量并用数字表示出来。美国艺术家A.Munsell设计的Munsell法使用根据其色度(Munsell色度)，亮度(Munsell值)，和饱和度(Munsell色质)分类的纸片颜色分类系统，与标本颜色进行视觉比较。
一个与光线和颜色有关的国际组织已经开发了另外的用数字表示颜色的方法，此国际组织是总部设在奥地利维也纳Kegelgasse 27，A-1030的Commission Internationale de l’Eclairage(CIE)。这些方法中两个最著名的是Yxy颜色空间和L*a*b*颜色空间。根据CIE的定义，Yxy颜色空间设计于1931年，是以三刺激值XYZ为基础设计的；L*a*b*颜色空间设计于1976年，目的是提供与视觉差异有关的更多的标准颜色差异。现在这些颜色空间*被用于全世界的颜色交流。Hunter Lab颜色空间是由R.S.Hunter于1948年提出的，它是一种可以直接从光电比色计读数的标准颜色空间(三刺激法)。
L*C*h颜色空间使用与L*a*b*颜色空间相同的图形，但L*C*h使用圆柱形坐标而不是矩形坐标。在这种颜色空间中，L*表示亮度并与L*a*b*颜色空间中的L*相同，C*为色质，而h为色度角度。中心的色质C的值为0，并随与中心的距离而增加。色度角度被定义为从L*a*b*空间的+a轴开始，并以逆时针旋转的程度来表示。因此，与L*a*b*空间相关，0°和360°将在+a*线上，90°将为+b*，180°将为-a*和270°将为-b*。
上述的所有方法都可以用于对棉花纤维颜色表型的精确测量。
实验提供下列实施例的目的是演示而非限定。
实施例lcDNA文库cDNA合成的组织制备从8英寸高的温室实生苗上分离叶片和根组织并迅速置于液氮中冷冻。收集处于快速扩展阶段的花开期前3天的花朵并冷冻。从已经从棉铃中分离出的花开期后2l天的子囊腔收集种子并完全冷冻于液氮。冷冻后，清除种子上的纤维并将裸露的种子用于RNA分离。所有的纤维在液氮中从种子上取下，并在分离RNA之前将纤维研成粉末。纤维来自在花开期加上标签的棉铃。
DNA和RNA操作用Stratagene公司的λZapIITMcDNA文库系统进行筛选，该文库用来源于poly-A+mRNA的cDNA进行制备，poly-A+mRNA是从Gossypium hirsutum栽培种Acala SJ-2的纤维中分离出来的。从在约21dpa时收获的棉铃中分离这些纤维，所用棉株是在以色列的大田种植的。
使用Hughes and Galau((1988)Plant Mol Biol Reporter，6253-257)的方法从21dpa的种子(G.hirsutum cv Coker 130，纤维已经被清除)中分离总RNA。所用其它的RNA根据Hall et al.((1978)，Proc NatlAcad Sci USA 753196-3200)的方法进行制备，并进行下述修改，第二次2M LiCl洗涤之后，将沉淀物溶于1/10原始体积的10mM TrispH7.5溶液并加入pH6.5的乙酸钾至终浓度为35mM，缓慢加入1/2体积的乙醇。将混合物置于冰上15分钟，然后4℃20,000g离心15分钟。将乙酸钾浓度加至0.2M，加入21/2体积的乙醇并将RNA置于-20℃几个小时。将沉淀在4℃12,000g离心30分钟并将沉淀物重悬于焦碳酸二乙酯处理的水中。利用寡聚(dT)-纤维素试剂盒(BectonDickenson)并按照制造商提供的方案从总mRNA中分离poly-A+RNA。
按下述方法制备棉花基因组DNA。将4g幼嫩棉花叶片组织(cvCoker 130)在液氮中研成粉末并置于预先加有0.4g聚乙烯吡咯烷酮的栎缘管中，在样品中加入20ml提取缓冲液(200mM Ches/NaOH pH9.1，200mM NaCl，100mM EDTA/NaOH pH9.0，2％SDS，0.5％脱氧胆酸钠，2％Nonidet NP-40，20mM β-巯基乙醇)，轻轻混匀并在一个摇动的65℃水浴中温育10分钟。加入7ml 5M乙酸钾pH6.5并仔细混匀。置冰上保温30分钟，每5分钟轻轻混合一次。将样品以21,000g离心20分钟，用纱布将上清过滤到另外一个管内并按上述进行离心。用纱布再次将上清液过滤到一个装有15ml室温异丙醇的栎缘管中。轻轻混合后，将样品于室温放置10-60分钟直到DNA沉淀出来。将DNA缠起并置于空气中干燥，干燥后重悬于4ml置于冰上的TE缓冲液并放置1小时。加入CsCl至终浓度为0.97g/ml并在装满VTi80快封管之前加入300μl 10mg/ml的溴乙锭。将样品以225,000g离心过夜。用水饱和的丁醇提取DNA并在加入2倍体积的乙醇之前加入足够的水至体积为4ml。将DNA缠起，空气干燥并重悬于200μl无菌水。
Northern和Southern分析进行Northern分析，从各种组织中分离出10μg总RNA，在1.2％琼脂糖-甲醛凝胶中电泳分离并转移到Nytran Plus膜(Schleicher and Schuell)上。杂交条件由含有50％甲酰胺(v/v)，5xSSC，0.1％SDS，5mM EDTA，10xDenhardts溶液，25mM磷酸钠pH6.5和250μg/ml载体DNA的溶液组成。在42℃用2xSSC，0.1％SDS洗涤3次，每次30分钟。
将棉花基因组DNA(12μg)用各种限制性内切酶消化，在0.9％琼脂糖凝胶中电泳并转移到Nytran Plus膜上。3’特异性和全长cDNA插入物探针的杂交和过滤洗涤条件按Northern分析中描述的进行。
来源于3’非翻译区的探针通过来自Rac13 cDNA的寡聚核苷酸引物进行合成，这些引物对应于碱基600-619和843-864(图4)。将每套引物用于聚合酶链式反应以合成3’特异性DNA序列的拷贝。在聚合酶链式反应中，这些序列用作产生脱离反义链的32P标记的单链探针的模板。使用Prime-It试剂盒(Stratagene)将Rac13的全长cDNA插入序列用作双链的随机引导的探针的模板。
实施例2棉花cDNA克隆的分离从上面描述的棉花纤维cDNA文库中分离出了4-4克隆的cDNA，此cDNA是在纤维中表达，在其它组织中不表达。此序列与任何已知的蛋白没有关系。在此克隆中只存在400kb的编码序列，所以使用此cDNA重新筛选了文库以获得全长的克隆。在
图1中提供了全长的编码序列。
通过用国家生物技术信息中心提供的BLAST服务将随机cDNA克隆的序列与各种序列数据库进行比较，发现了一个命名为#105的克隆的编码序列与一个已经报道的脂转运蛋白的编码序列有关。
分析了另外一个克隆的序列，序列显示此克隆与动物Rac蛋白具有高的同源性。被命名为Rac的这个克隆不是全长的克隆，所以用这个起始的Rac DNA片段作探针重新筛选了文库。在被筛选的约130,000个噬斑中，56个为阳性；在这些阳性克隆中，分离出了14个克隆并进行了序列测定。在这14个克隆中，有12个克隆显示了与原始的Rac克隆相同的序列同源性，且这些cDNA克隆中的一个克隆编码了全长的cDNA并被命名为Rac13。图4显示编码在棉花纤维中表达的Rac13基因的cDNA序列。
另外一个非全长的命名为Rac9的cDNA克隆，与Rac13有明显的相关但DNA和氨基酸序列明显不同于Rac13。重新筛选150,000个噬斑，分离到了36个阳性克隆，其中只有两个克隆与Rac9序列相对应(两个都是全长克隆)，其余的都是Rac13。这些结果提示棉花中至少含有两个明显不同的Rac蛋白的基因。基于多次的克隆分离，发现在花开期后(dpa)21天的棉花纤维中Rac13的表达量相对较高而Rac9相对较低，花开期后21天是分离poly A+mRNA用于文库构建的时间。
将Rac13的推导氨基酸序列与其它的小G-蛋白的序列相比较显示棉花Rac蛋白与Rho1蛋白序列紧密相关，此Rho1蛋白序列是根据最近从豌豆中分离的cDNA克隆(Yang and Watson，见上)推导出来的。除了豌豆Rho1外，动物Rac蛋白与棉花Rac蛋白的同源性最高。rho亚族的其它蛋白，诸如酵母CDC42和人RhoA，也与棉花Rac基因明显相关。相反，从植物中分离的Rab/YPT亚族的其它小G-蛋白，诸如烟草RAB5蛋白和人Ras蛋白，在所有比较过的小G-蛋白中与棉花Rac蛋白的同源性最低。这些棉花和豌豆蛋白和哺乳动物Rac蛋白的等电点均高于9，而其它的rho和ras蛋白的等电点在5.0-6.5的范围内。
实施例3棉花纤维基因在正在发育的纤维中的表达使用从各种棉花组织中和处于不同发育阶段的纤维中制备的mRNA评估Rac13和4-4基因的表达。将转移到膜上的mRNA与来源于Ltp，Rac13和4-4基因非翻译区的探针杂交。Rac13的基因在纤维中显示高度增强的表达；即使在延长发育时间的条件下，在叶，根或花组织中也检测不到此mRNA的存在。在纤维组织中观察到Rac13最高表达水平的同一发育阶段，种子中也检测到了Rac13的表达。Rac13在纤维中的表达模式紧密依赖于发育阶段。在原生细胞壁合成阶段(0-14dpa，参见Meinert and Delmer，1977)时表达很低，在向次生细胞壁合成的转移阶段(15-18dpa)时表达达到最高，在最高次生细胞壁纤维素合成阶段(约24-28dpa)时表达开始降低。
在纤维细胞中4-4 mRNA的积累开始于花开期后17天并一直持续到至少花开期后35天。mRNA水平在花开期后21天达到最高并保持高水平。在其它棉花组织中没有检测到4-4 mRNA，在花开期后17天之前的纤维组织中也没有检测到。
#105脂转运蛋白cDNA克隆被用作棉花纤维的探针并用于棉花纤维Northern分析。Northern分析显示棉花纤维Ltp在棉花纤维中有高水平的表达。编码此蛋白的mRNA以极高的水平在整个纤维发育过程中表达。Northern杂交结果显示此mRNA在5dpa时开始表达并以高水平持续表达至40dpa。
实施例4基因组DNA4-4和Rac13的cDNA都被用作探针以钓取基因组克隆。使用从棉花品种Coker 130(Gossypium hirsutum cv.coker 130)的发芽的实生苗获得的DNA构建基因组DNA文库，并用两个探针从此基因组文库中获得了全长的基因组DNA，基因组文库构建所用的载体是StratageneTM的λ-2载体。
用3’特异性Ltp探针调查了棉花基因组并鉴定纯化了6个基因组噬菌体候选者。图7提供了一段约2kb的Ltp启动子区序列，此序列紧接Ltp编码区的5’端。
使用Ltp mRNA的3’特异性探针，从棉花基因组文库中鉴定出了6个基因组噬菌体克隆。此工作目的是从棉花的Ltp基因家族中选择在棉花中表达量最大的Ltp基因的启动子。在纤维发育的整个阶段此Ltp启动子都是有活性的。
实施例54-4启动子构建体的制备pCGN5606第一版的pCGN5606启动子构建体(版本I)包括4-4棉花纤维表达盒(图2)。从核苷酸(nt)1至65和nt5,494至5,547的序列与克隆此盒的pBluescript II多接头区的片段相对应。存在于这些位于盒两侧区域的单一限制酶位点允许将纤维表达盒克隆到包括pCGN5138和1547系列的双向载体上。
从nt57至5,494的序列包含在棉花Coker 130基因组文库的一个λ噬菌体克隆内。此λ基因组克隆被命名为4-4(6)。
从nt65至nt4,163的序列与4-4(6)基因的5’侧翼区域相对应。在nt4,163有一个NcoI限制酶识别序列，它与4-4(6)ORF的第一个密码子相对应。
从核苷酸4,163至4,502的区域与4-4(6)ORF的一部分相对应。从nt4,502至nt4,555的序列是一个合成的多接头寡聚核苷酸，它包含限制酶EcoRI，SmaI，SalI，NheI和BglII的单一识别位点。这个从nt4,163至4,555的片段是一个填充片段，目的是为了方便克隆操作的控制。
可以将在棉花纤维细胞中表达的基因用此盒克隆到NcoI限制酶识别位点和任何多接头识别位点之间。此操作将用所感兴趣的基因替代填充片段。从nt4,555至5,494的区域与终止密码子的下游940个核苷酸相对应并构成了4-4(6)基因的3’端区域。在nt5483处有一个单一的AscI限制酶位点。
pCGN5610pCGN5610构建体是4-4棉花纤维表达盒的第二版，即版本II，是pCGN5606的一个修饰版本。4-4棉花纤维表达盒的两个版本被设计成允许将两个纤维盒一前一后地克隆到一个双向载体中。关于pCGN5606的差异是很小的并描述如下。
通过标准克隆操作删除了从nt1至65区域中的XbaI限制酶位点。多接头区位于pCGN5606的反方向内。在nt5484处有一个单一的XbaI限制酶位点。pCGN5610的从nt1至57和nt5,494至5,518的序列与克隆此盒的pBluescript II多接头区的片段相对应。存在于这些位于盒两侧区域的单一限制酶位点允许将纤维表达盒克隆到包括pCGN5138和1547系列的双向载体上。
从nt57至5,494的序列包含在棉花Coker 130基因组文库的一个λ噬菌体克隆内。此克隆被命名为λ基因组克隆4-4(6)。从nt57至nt4,155的区域与4-4(6)基因的5’侧区域相对应。在nt4,155有一个NcoI限制酶识别序列，它与4-4(6)ORF的第一个密码子相对应。从核苷酸4,156至4,500的区域与4-4(6)ORF的一部分相对应。这个从nt4,156至4,550的片段是一个填充片段，目的是为了方便克隆操作的控制。从nt4,500至nt4,550的序列是一个合成的多接头寡聚核苷酸，它包含限制酶BglII，NheI，SalI，SmaI和EcoRI的单一识别位点。
用此盒可以将在棉花纤维细胞中表达的基因克隆到NcoI限制酶识别位点和任何多接头识别位点之间。此操作将用所感兴趣的基因替代填充片段。从nt4,550至5,494的区域与终止密码子的下游940个核苷酸相对应并构成了4-4(6)基因的3’端区域。
实施例6Rac13启动子构建体的制备基因组克隆从一个命名为15-1的基因组克隆，用限制性内切酶完成了图谱分析。鉴定了具有Rac13编码区的最大片段。其中有一个Pst片段，当被亚克隆到BluescriptTMKS+载体(BSKS+；Stratagene)中时被命名为pCGN4722。插入片段长度为9.2kb。
鉴定了具有Rac13密码序列的Pst片段区。测定了起始密码子的5’端约1.7kb和终止密码子的3’端约1.2kb的DNA序列。NdeI位点位于整个Rac编码区(外显子和内含子)的两侧。
用XbaI消化pCGN4722，去掉一个2.7kb的片段。重新连接形成pCGN4730，然后用NdeI消化，获得一个包含整个Rac密码区的1.7kb片段。重新连接即可获得pCGN4731。
用重叠的合成寡聚核苷酸产生一个多接头区，此重叠的合成寡聚核苷酸是用与重新合成部分的5’和3’端同源的引物进行聚合酶链式反应扩增的。得到的产物用EcoRI和HindIII消化并连接到BSKS+的EcoRI和HindIII位点。得到的质粒被命名为pCGN4733。
用NdeI消化pCGN4731和pCGN4733，将pCGN4733的包含合成多接头区的NdeI片段连接到4731的NdeI位点就获得了pCGN4734。用Sal和Xba消化这个pCGN4734即可获得pCGN5133。pCGN5133是BSKS+中的一个9.2kb的Pst片段，其中将插入片段两侧的多接头位点改变成不同的位点以利于操作。然后将pCGN4734的片段置于pCGN5143的相同位点内，即可得到pCGN4735。
图5提供了启动子构建体pCGN4735的约3kb片段的序列。将重新合成的序列整合到位于此序列的碱基1706和1898的NdeI位点之间。因此，图5的序列包括约1.7kb的NdeI位点5’端到重新合成序列区的5’序列。图5中没有提供的是此序列5’端的一个大约2.5kb的序列，它与整个的9.2kb插入片段有关。图5的序列还包括约1.1kb的3’端到3'NdeI位点的序列。图5没有提供Rac13插入片段3’末端的约3kb的序列。图6提供了pCGN4735的图谱。
实施例7色素合成基因黑色素用于植物转化以表达黑色素合成基因的双向构建体按下述进行制备。黑色素基因是从普通土壤细菌抗生链霉菌中分离出来的(Bernan et al.(1985)34101-110)。黑色素产生是由一个双基因系统组成的，第一个基因，tyrA，编码负责第一底物酪氨酸聚合的催化亚基，并被称为酪氨酸酶。第二个基因，ORF438，负责结合铜原子并将铜原子转移到酪氨酸酶以激活此酶。ORF438和tyrA的表达确保了最大的酪氨酸酶活性。
参考其DNA序列完全重新合成了ORF438和tyrA的基因。这是因为从链霉菌分离的原始DNA序列具有很高的鸟嘌呤和胞嘧啶(G+C)DNA含量。因此，参考编码其相应氨基酸的植物优选密码子重新合成了ORF438和tyrA基因以使其更象植物基因(降低了G+C含量)。
靛蓝靛蓝产生包括将第一底物色氨酸转化成吲哚，然后转化成吲哚酚。在有氧的情况下吲哚酚分子自发转化成靛蓝。使用了一个双基因系统以影响纤维细胞中靛蓝的产生。第一个基因(tna)是从大肠杆菌中获得的，它编码色氨酸酶。tna表示编码大肠杆菌色氨酸酶的基因，此酶将色氨酸转化成吲哚(Stewart et al.，(1986)J Bacteriol 166217-223)。
pig用于表示来源于红球菌的负责靛蓝产生的蛋白的编码序列，此蛋白将吲哚转化成靛蓝(Har et al.，(1990)J Gen Micorbiol 1361357-1363)。tna和pig都是通过聚合酶链式反应(PCR)获得的。色氨酸酶负责将色氨酸转化成吲哚，而第二个基因(pig)编码一个负责将吲哚转化成吲哚酚的吲哚加氧酶。这两个细菌基因都是以天然形式被利用的。
实施例8导向色素合成基因的构建体为了导向质体，这些构建体包含一个烟草二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因的片段，此片段编码转运肽和成熟蛋白(Tssu)的12个氨基酸且位于具有适当编码序列的阅读框架中。
为了黑色素合成基因的导向液泡，构建体包含金属羧肽酶抑制剂基因的一个片段，此片段编码蛋白的N-末端信号序列的全部32个氨基酸和成熟蛋白的6个氨基酸(CPI+6)(Martineau et a1.，见上)，且位于具有适当编码序列的阅读框架中。除了信号肽外，将编码液泡定位信号(VLS)的一段序列插入到此蛋白编码序列的3’端。
黑色素根据最终蛋白产物定位于纤维细胞的哪个区域，用两种不同的方式处理重新合成的ORF438和tyrA基因。一个嵌合基因/植物双向构建体(命名为pCGN5 148)包含导向纤维细胞质体的基因。为了达到这个目的，将编码羧化酶小亚基(SSU)的基因的12个氨基酸和原始的54个氨基酸的SSU转运肽相应地融合到ORF438和tyrA基因产物的氨基端。这些肽序列使得ORF438和tyrA基因产物(蛋白质)可以有效地导向到质体上。因为在纤维细胞内质体是酪氨酸产生的位点，所以启动了这种导向。
第二个嵌合基因/植物双向构建体(命名为pCGN5149)包含导向到纤维细胞内液泡的ORF438和tyrA基因。根据来源于其它生物系统的信息，推测纤维细胞液泡中含有高浓度的黑色素聚合所需的酪氨酸。ORF438和tyrA基因都含有来源于番茄羧肽酶抑制剂(CPI)蛋白的29个氨基酸的信号肽，此信号肽用于氨基端的基因融合以指导这些蛋白到纤维细胞的内质网(ER)分泌系统中。
另外，将来源于CPI的8个氨基酸的液泡导向肽(VTP)融合到tyrA的羧基端以使成熟的铜激活的酪氨酸酶最终被导向到纤维细胞的液泡中。ORF438和tyrA蛋白还都具有潜在的糖基化位点，可以相应地通过ORF438和tyrA基因的定点突变将其去除。这些蛋白在纤维细胞中表达后的潜在的植物细胞糖基化作用可能导致酪氨酸酶的失活，因此去除潜在的糖基化位点被认为是必要的。
靛蓝这些靛蓝基因的唯一修饰是将烟草SSU转运肽的编码DNA序列融合到tna和pig基因的氨基末端，以影响色氨酸酶和吲哚加氧酶蛋白在纤维细胞质体上的定位。这些融合操作和构建体5148中的用于黑色素产生的质体导向蛋白的基因融合是相同的。rna和pig基因产物被导向到纤维细胞质体中，因为质体是色氨酸合成的主要位置。
实施例9表达构建体黑色素将导向质体和液泡的ORF438和酪氨酸酶蛋白的修饰基因置于一个在棉花纤维细胞的发育过程中被打开的纤维表达盒中。用于黑色素构建体的“开关”(启动子)是4-4。将修饰的ORF438和tyrA基因克隆到4-4启动子盒中，然后将这些嵌合基因插入一个双向载体中以产生质粒pCGN5148和pCGN5149，这两个质粒相应地含有导向到质体和液泡的ORF438和酪氨酸酶蛋白的修饰基因。这些双向载体还含有维持其在大肠杆菌和农杆菌中稳定存在的遗传因子，还含有一个细菌卡那霉素抗性基因在植物细胞表达的嵌合基因。当植物下胚轴或叶片部分用含有这些双向载体的农杆菌感染时，此卡那霉素抗性标记用于转化的相对于非转化的棉花细胞的选择。
具有液泡导向序列的质粒pCGN5149的分区图形显示于图8。质粒pCGN5148(未示出)的构建与5149相同，只是pCGN5148具有质体导向序列。
靛蓝就象黑色素基因一样，将质体导向的tna和pig基因置于纤维特异性的4-4启动子盒中，然后将这些嵌合基因插入一个双向质粒以产生质粒pCGN5616。质粒pCGN5616的分区图形显示于图8。
花色素苷为了在发育的棉花纤维中表达玉米R和CI基因，构建了一个构建体。已知这些基因负责通过以调控方式打开花色素苷(红色光谱颜色)产生的苯基苯乙烯酮途径来产生花色素苷类色素。将R和CI基因置于Rac13启动子盒的控制之下。一个命名为pCGN4745的双向载体(未示出)含有R和CI基因并都在Rac13启动子的控制之下。
实施例10棉花转化外植体制备将Coker 315种子置于50％Clorox溶液(2.5％次氯酸钠溶液)中20分钟进行表面消毒并在无菌蒸馏水中洗涤3次。表面消毒完成后，将种子置于含有25ml 1/2xMS盐溶液1/2xB5维生素1.5％葡萄糖0.3％琼脂的25x150无菌管中发芽。实生苗在28℃黑暗中生长7天。在第七天将实生苗置于28±2℃的光照下。
共培养和植株再生将含有双向质粒pCGN2917和pCGN2926的根癌农杆菌菌株2760的单菌落转移到5ml的MG/L液体培养基中并在30℃生长过夜。在共培养之前用MG/L将细菌培养物稀释到1×108细胞/ml。从8天龄的实生苗上取下下胚轴，切成0.5-0.7cm的小块并置于烟草饲养平板上(Horsch et al.1985)。在使用前一天，将1.0ml烟草悬浮培养物平铺于含有不含抗生素的愈伤组织起始培养基CIM(MS盐溶液B5维生素3％葡萄糖0.1mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)0.1mg/L激动素0.3％琼脂，在高压灭菌之前将pH值调到5.8)的培养皿上来制备饲养平板。在使用之前将一片无菌滤纸(Whatman#1)置于饲养细胞之上。所有的小块制备好后，将每个小块浸入一个根癌农杆菌培养物中，置于无菌纸巾上并放回烟草饲养平板上。
在饲养平板上共培养2天后，将下胚轴小块置于含有75mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的新鲜愈伤组织起始培养基上。将组织培养在28±2℃，30μE 168光周期中4星期。在4星期时将整个外植体转移到含有抗生素的新鲜愈伤组织起始培养基上，第二次筛选2星期后，将愈伤组织从外植体上取下并在愈伤组织起始培养基和再生培养基(MS盐溶液40mM KNO310mM NH4ClB5维生素3％葡萄糖0.3％琼脂400mg/L羧苄青霉素75mg/L卡那霉素)之间分开。
在愈伤起始后2-6个月鉴定胚胎发生愈伤组织并传代培养到新鲜再生培养基上。选择胚胎进行发芽，置于静态液体催胚培养基(Stewart and Hsu培养基0.01mg/L萘乙酸0.01mg/L激动素0.2mg/LGA3(赤霉素3))中并在30℃培养过夜。将胚胎置于纸巾上并放入含有40ml的用琼脂固化的Stewart and Hsu培养基的Magenta盒中。将正在发芽的胚胎保持在28±2℃ 50μEm-2s-1的168光周期中。将生根的小植株移植到土壤中并在温室中生长。
在生长箱内棉花的生长条件如下16小时光周期，约80-85°F的温度，约500μE(爱因斯坦单位)的光密度。在温室中棉花的生长条件如下14-16小时光周期，至少400μE(爱因斯坦单位)的光密度，白天温度90-95°F，晚上温度70-75°F，相对湿度约80％。
植株分析在温室中将处于花开期的温室生长T1植株的花加上标签。在发育的不同阶段从这些植株上收获棉花花苞，花，棉铃等并分析其酶活性。按Martineau et a1.，的未决专利申请(见上)描述的方法对样品进行GUS荧光测定和组织化学分析。为了分析纤维颜色特性，可以对植株进行目测分析，如果必要，可以进行Northern或Western分析。
实施例11转基因的色素合成基因的表达黑色素通过叶片分析和相应的Western分析，显示卡那霉素选择性标记抗性的植株被认为是转化植株。在纤维发育的不同阶段从个体转化植株上收集转基因的纤维并在两天内进行分析。一个是分析每个转基因棉花植株在一个单一的发育时间点的纤维，以比较转基因事件之间的酪氨酸酶表达。另外一个是从被选择的植株中筛选发育的纤维以分析酪氨酸酶在纤维特异性4-4启动子控制下的表达时间表，分析方法是用抗纯化的酪氨酸酶蛋白的抗血清进行Western杂交。
13个被筛选的质体导向构建体pCGN5148的转化事件中有9个酪氨酸酶表达为阳性，而16个被筛选的液泡导向构建体pCGN5149的转化事件中有13个阳性。在酪氨酸酶表达阳性的植株的纤维中的表达水平为纤维细胞蛋白的约0.1％-0.5％。可以清楚地看出，包括DNA颜色构建体的棉花纤维细胞产生了色素合成所需要的必要蛋白。
可以看到，酪氨酸酶阳性植株的棉绒显示不同深度的颜色，而没有表达酪氨酸酶的植株不显示任何颜色。Coker 130对照植株的和用pCGN5 148转化的植株的棉花纤维的比色计测定结果相应地显示于图9和10。
pCGN5148(质体导向的)植株的纤维显示一种蓝绿色的表型。当用L*a*b*颜色空间进行测量时，一个转化事件5148-50-2-1包括着色的和具有低于-8.0的负a*值的棉花纤维细胞(棉绒纤维)。Coker 130棉花纤维细胞没有典型地显示负a*值。这些着色的棉花细胞还具有一个位于L*C*h颜色空间的颜色，此颜色的色度角度值h相当高，大于135°。当用这种方法测量时，正常Coker 130的纤维具有一个不大于约90°的相似值。
图11提供了用pCGN5149转化的植株的棉花纤维的比色计测量结果。从构建体pCGN5149(液泡导向的)表达酪氨酸酶的植株的纤维倾向于具有一种浅棕色的表型。
靛蓝通过叶片分析和Western分析具有卡那霉素选择性标记抗性也是命名用pCGN5616转化的植株的标准。在不同的纤维发育阶段从个体转化植株上收集转基因的纤维。从被选择的植株中筛选转基因的发育纤维以分析tna和pig基因在纤维特异性4-4启动子控制下的表达时间表，并且还分析每个转基因棉花植株在一个单一的发育时间点的纤维以比较转基因事件之间的色氨酸酶和吲哚加氧酶的表达，分析方法是用抗色氨酸酶和吲哚加氧酶蛋白的抗血清进行Western杂交。
24个被筛选的植株中有15个色氨酸酶和吲哚加氧酶表达为阳性的植株。这些蛋白在纤维中的表达水平为纤维细胞蛋白的约0.05％-0.5％。这些转化植株中约有一半在纤维中表达两个基因并产生一个非常微弱的浅蓝色表型。可以看到，这些阳性植株的纤维中大多数都具有微弱的蓝色，尤其是在20-30dpa的未开裂棉铃的纤维中。
图12提供了用pCGN5616转化的植株的棉花纤维的比色计测量结果。当用L*a*b*颜色空间测量时，这些棉花纤维中有很多具有相当低的a*值(低于2)和提高的b*值(大于10)。相似的是，几个5149棉花纤维的a*值低于2而b*值高于10。
BC棉
图13提供了4个BC棉品系的天然着色纤维的比色计测量结果。
上述结果显示可以通过表达色素合成基因改变转基因的棉花纤维细胞的颜色表型。转基因的棉花纤维细胞包括一个色素合成蛋白和由色素合成蛋白产生的色素。如图9至13的结果所示，通过从一个遗传工程化的构建体表达所感兴趣的色素基因可以使棉花纤维细胞产生着色的棉花纤维，在棉花纤维细胞中色素的合成与适当的导向序列合并将导致所选择的植物组织中的颜色表型的修饰。
在本发明中引用的所有出版物和专利申请在本文作为参考文献，就象每个单独的出版物或专利申请被特殊地和单独地指定作为参考文献一样。
虽然为了清楚和理解的目的，上述的本发明已经以阐述和举例的方式被详细描述，但是本领域熟练技术人员都非常明白可以对其进行某些变化和修饰而不背离附加的权利要求的精神或范围。
权利要求
1.一种DNA构建体，在转录方向上包括作为可操作连接的成分的一种棉花纤维转录因子和编码感兴趣蛋白的开放阅读框架，其中所说的转录因子选自Ltp，4-4和rac启动子序列。
2.根据权利要求1的DNA构建体，进一步包括来源于植物核编码基因的转运信号编码序列。
3.根据权利要求2的DNA构建体，其中所说的转运信号编码序列包括一种质体转运肽。
4.根据权利要求1的DNA构建体，其中所说的转运信号编码序列编码一种提供跨粗面型内质网运输的信号肽。
5.根据权利要求4的DNA构建体，其中所说的序列进一步包括，位于所说的开放阅读框架3’端的液泡定位信号。
6.权利要求1的DNA构建体，其中所说的色素是黑色素或靛蓝。
7.权利要求6的DNA构建体，其中所说的开放阅读框架来源于一种细菌基因。
8.权利要求7的DNA构建体，其中所说的细菌基因选自ORF438，tyrA，花色素苷R基因，花色素苷C1基因，pig，和tna。
9.一种包括权利要求1的DNA构建体的植物细胞。
10.根据权利要求9的棉花植株细胞。
11.根据权利要求10的棉花纤维细胞。
12.一种包括权利要求9-11所述的任何一种细胞的植株。
13.一种修饰棉花植株的纤维表型的方法，所说的方法包括用包括用于表达色素生物合成途径中的蛋白的构建体的DNA转化植物细胞，其中所说的构建体包括如下的可操作连接的成分一个在所说的棉花植株的细胞中发挥功能的转录起始区，一个编码所感兴趣蛋白的开放阅读框架，和一个在所说的棉花植株的细胞中发挥功能的转录终止区，其中所说的植物细胞包括所说蛋白的底物；以及培育所说的植物细胞以产生一个棉花植株，其中所说的蛋白与所说的底物反应以产生所说的色素。
14.权利要求13的方法，其中所说的构建体进一步包括来源于植物核编码基因的转运信号编码序列。
15.权利要求13的方法，其中所说的转运信号编码序列编码一个提供跨粗面型内质网运输的信号肽。
16.权利要求13的方法，其中所说的DNA包括用于表达色素生物合成途径中的两个蛋白的构建体，其中每个所说的构建体包括成分i)到iv)，且所说的两个蛋白不是由相同的基因编码的。
17.权利要求16的方法，其中所说的色素是黑色素，所说的蛋白是由tyrA和ORF438编码的。
18.权利要求16的方法，其中所说的色素是靛蓝，所说的蛋白是tna和pig。
19.权利要求16的方法，其中所说的色素是花色素苷，所说的构建体包括花色素苷R和C1调节基因。
20.权利要求13的方法，其中所说的植物细胞是棉花纤维细胞，所说的转录区是纤维组织转录起始区。
21.权利要求20的方法，其中所说的转录区选自Ltp，4-4和rac启动子序列。
22.一种包括图2所示的棉花组织转录序列的重组DNA构建体。
23.一种包括图5所示的棉花组织转录序列的重组DNA构建体。
24.一种编码
图1的序列的分离的DNA。
25.一种编码图4的序列的分离的DNA。
26.权利要求13的方法，其中所说的感兴趣蛋白参与植物激素的合成。
27.一种包括图7的棉花脂转运蛋白编码序列的分离的DNA序列。
28.包括一种DNA序列的棉花纤维细胞，其中所说的DNA序列包括在转录方向上作为可操作连接的成分的一种棉花纤维转录因子和编码一个色素合成所需蛋白的开放阅读框架。
29.根据权利要求27的棉花纤维细胞，包括由所说的色素合成蛋白产生的色素。
30.根据权利要求27的棉花纤维细胞，其中所说的DNA序列进一步包括一种来源于植物核编码基因的转运信号编码序列。
31.根据权利要求29的棉花纤维细胞，其中所说的转运信号编码序列包括一种质体转运肽。
32.根据权利要求29的棉花纤维细胞，其中所说的转运信号编码序列编码一种提供跨粗面型内质网运输的信号肽。
33.根据权利要求31的棉花纤维细胞，其中所说的序列进一步包括，位于所说的开放阅读框架3’端的液泡定位信号。
34.根据权利要求27的棉花纤维细胞，其中所说的转录因子选自棉花纤维脂转运启动子序列，4-4启动子序列和rac启动子序列。
35.根据权利要求27的棉花纤维细胞，其中所说的色素是黑色素或靛蓝。
36.根据权利要求27的棉花纤维细胞，其中所说的开放阅读框架来源于一种细菌基因。
37.根据权利要求35的棉花纤维细胞，其中所说的细菌基因选自ORF438，tyrA，花色素苷R基因，花色素苷C1基因，pig，和tna。
38.一种包括黑色素的棉花纤维细胞。
39.一种包括靛蓝的棉花纤维细胞。
40.一种通过基因工程着色并具有一个用L*a*b*颜色空间测量时小于-1.0的负a*值的棉花纤维细胞。
41.权利要求39的棉花纤维细胞，其中所说的负a*值小于-5.0。
42.权利要求40的棉花纤维细胞，其中所说的负a*值小于-8.0。
43.一种通过基因工程着色并具有一个用L*a*b*颜色空间测量时小于2.0的a*值和大于10的b*值的棉花纤维细胞。
44.一种通过基因工程着色并具有一个用L*C*h颜色空间测量时大于100°的色度角度值h的棉花纤维细胞。
45.权利要求43的棉花纤维细胞，其中所说的h值大于135°。
全文摘要
本发明提供了可以用作分子探针或可以在棉花纤维发育的不同阶段插入某植物宿主以提供对感兴趣的DNA序列转录的修饰的全新DNA构建体。这些DNA构建体包括一个与在棉花纤维中表达的基因相关的棉花纤维转录起始调控区。本发明还提供了一种新的棉花,这种棉花纤维具有因使用这种构建体在棉花纤维细胞中表达色素合成基因而产生的天然颜色。本发明还包括通过遗传工程产生的有颜色的棉花纤维细胞和包括黑色素和靛蓝色素的棉花细胞。
文档编号A01H5/00GK1189852SQ96195198
公开日1998年8月5日 申请日期1996年6月7日 优先权日1996年6月7日
发明者凯文·麦克布赖德, 大卫·M·斯托克, 朱莉·R·皮尔, 路易斯·佩雷斯－格劳 申请人:卡尔金公司