专利名称：杀昆虫剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及来自细菌，更特别地来自致病杆菌属(Xenorhabdus)种类的有杀昆虫活性的物质、制剂和组合物。本发明也涉及应用这些化合物和组合物的生物和方法。
目前需要具有杀昆虫活性的物质、制剂、组合物和生物以用于例如农作物保护或昆虫介导的病害控制。需要新的物质以克服对现有杀虫剂的抗性问题。这样的物质理想地是生产便宜、有高度活性的(无论是单独使用或联合使用)并且在目的害虫经口摄入时有效。因而，任何提供使这些特性增强的物质、制剂、组合物或生物的发明都代表现有技术的进步。
在自然界，致病杆菌属种类往往与线虫寄主共生，已知这种共生可用于控制害虫活动。例如，已知某种致病杆菌属种类单独注射入宿主血管体腔时能杀死寄主昆虫。
另外，一种胞外杀昆虫毒素已从光杆状菌(Photorhabdusluminescens)分离出来(这个种最近已从致病杆菌属分出，但与该属种类亲缘关系很近)。这种毒素摄入时是无效的，但注射入某种昆虫幼虫时是高毒性的(见昆虫寄生虫和病原体，第二卷，Beckage,N.E.等编，学术出版社，1993)。
也已知来自光杆状菌(P.luminescens)和嗜线虫致病杆菌(X.nematophilus)的某些低分子量杂环化合物静脉注射或局部施用时具有抗生特性(见Rhodes,S.H.等，PCT WO84/01775)遗憾的是，这些现有技术物质都没有上述理想的杀虫特性，特别是经口施用时没有毒性。
本发明提供来自致病杆菌属种类的杀昆虫制剂和组合物、产生这样的化合物和组合物的生物以及使用这些制剂、组合物和生物的方法，所有这些减少了现行技术的某些问题。
根据本发明的一个方面，公开了杀灭或控制昆虫虫害的一种方法，包括经口部向害虫施用来自致病杆菌的细胞或者从其衍生或得到的杀昆虫物质。
公开为WO95/00647的CSIRO的PCT申请公开了来自嗜线虫致病杆菌的表观毒性蛋白；但是没有给出蛋白毒性的细节，并且的确没有公开其作为口入杀昆虫剂的用途。
因此，本发明提供一种适于经口施用给昆虫的杀昆虫组合物，此组合物包含可从致病杆菌属种类获得的杀昆虫物质或其杀昆虫片段或二者中任一的杀昆虫变体或衍生物。
事实上，这种组合物可以包含致病杆菌属种类细胞或选择性地取自致病杆菌细胞培养物的上清液。然而，组合物优选地含有如下文所述从致病杆菌分离的毒素。毒素已经与图2的核苷酸序列编码的物质联系起来。因此，组合物相应地含有图2所有或部分核苷酸序列编码的杀昆虫物质。也可以使用这样的毒素的杀虫片段及变体或衍生物。
图2的序列是40Kb长度的顺序。相信这个序列可编码一种以上的蛋白，每种蛋白单独或一起时可以调节或有杀昆虫性。常规要测定哪部分对于杀昆虫活性是必需或充分的。
此处所用的术语“变体”是指改变了氨基酸序列但还具有相似活性的毒素。某些氨基酸被各种氨基酸替换但不显著改变活性。替换可以是“保守替换”的方式，即氨基酸被具广义相似特性的氨基酸替换；或者可以是某些非保守替换。但是，一般而言，变体与天然毒素至少60％同源性；优选地至少70％同源性；更优选地至少90％同源性。
术语“衍生物”涉及已经用例如化学或生物方法修饰的毒素。
这些毒素是新的，并且它们及编码它们的核酸构成本发明的另一方面。
优选的致病杆菌属种类是细菌嗜线虫致病杆菌。本发明内容中所用的嗜线虫致病杆菌的特异菌株是ATTC 19061菌株，可从英国国立工业和海洋微生物保藏有限公司，Aberdeen,Scotland(NCIMB)得到。此外，适用的菌株包括1997年7月10日保藏于NCIMB并得到保藏登记号为NCIMB 40886和NCIMB 40887的两个致病杆菌新菌株。后两个菌株构成本发明的另一方面。
所有菌株都有下表1所列的共同特性。表1菌株
*NBTA(含0.0025％溴麝香草酚蓝和0.004％氯化四唑的氧化物营养琼脂)优选地目的害虫是昆虫，更优选地是鳞翅目的昆虫，特别是大菜粉蝶(Pieris brassicae)、小菜粉蝶(Pieris rapae)或菜蛾(Plutella xylostella)；或者膜翅目的昆虫，特别是五带淡色库蚊(Culex quinquefaciatus)。
在本发明优选的实施方案中，致病杆菌属种类的细胞或由其得来的制剂与苏云金芽孢杆菌结合使用作为口入杀昆虫剂。
在进一步的实施方案中，不是苏云金芽孢杆菌本身而是来自苏云金芽孢杆菌的杀昆虫物质(例如δ内毒素或其它分离物)与致病杆菌结合使用。
术语“可从……得到(Obtainable from)”一词意味着不仅包含从该细菌直接分离的物质，而且包含随后克隆入其它生物并由其合成的物质。
因此，出乎意料的发现致病杆菌属细菌(及由其得来的物质)被摄入时有杀昆虫活性以及这种细菌和物质与苏云金芽孢杆菌(以及来自该菌的毒素或物质)结合使用更有利，构成了本发明第一方面的基础。苏云金芽孢杆菌分离物本身的杀昆虫活性已有文献广泛证明。但是以前尚未证明这些分离物与致病杆菌属细胞(或来自该菌的物质)的协同杀昆虫活性。
本发明更进一步的实施方案中，使用取自致病杆菌，特别是嗜线虫致病杆菌培养物的上清液代替上述来自致病杆菌属种类的细胞。
所有这些方法尤其可以用于控制害虫。
本发明还制备了含有来自致病杆菌属种类，优选地嗜线虫致病杆菌的细胞并与苏云金芽孢杆菌相结合的有效杀昆虫组合物。与上述方法一样，在本发明的组合物中可以使用来自苏云金芽孢杆菌的杀昆虫毒素(优选是δ内毒素)作为苏云金芽孢杆菌的替代物。
同样，取自致病杆菌，优选地嗜线虫致病杆菌培养物的上清液可以用于代替来自致病杆菌属种类的细胞。
这样的组合物尤其可以例如通过喷施农作物用于农作物保护或用于家畜保护。此外，本发明的组合物可以用于传病媒介昆虫的控制。
本发明进一步包括可从致病杆菌分离的新型杀昆虫剂。本领域技术人员应该懂得分离此种制剂的技术。
特别地，这种技术包括毒素蛋白在蛋白水平或DNA水平上的分离和鉴定。
申请人已从致病杆菌NCIMB 40887克隆了编码杀昆虫活性的DNA区域，并对其进行了部分测序，序列示于下文图2(SEQ ID NO.1)。因此，在本发明的优选实施方案中还提供SEQ ID No.1的DNA或其变体或片段编码的毒素。
本发明还提供编码此毒素的重组DNA。本发明的重组DNA可以包含图2的序列或其变体或片段。由于遗传密码的兼并性，其它DNA序列可以编码相似蛋白。所有这样的序列都包括于本发明中。
此处提供的序列足以使可用于鉴定和随后提取毒素基因DNA的探针得到制备。如本领域已知的，然后可以将此DNA克隆进载体和宿主细胞。
包含图2序列或在严格条件下与图2序列杂交的DNA构成本发明的另一方面。
表达方式“与…杂交”是指在严格杂交条件下核苷酸序列将退火成图2的全部或部分序列，例如《分子克隆操作手册》中所述的，该书由Sambrook,Fritsch和Maniatis编辑，由冷泉港实验室出版社出版于纽约冷泉港。
用于特定分析技术的序列长度将依赖于技术的性质、序列互补程度、序列性质、特别是探针或引物的GC含量以及所用的特定杂交条件。在高严格条件下，只有完全互补的序列结合，但在低严格条件下，与靶序列有60％，优选的80％同源性的序列将结合。高和低的严格条件都包括在这里所用的术语“严格条件”之中。
图2DNA的适当片段，即编码杀昆虫剂的那些片段，可以用标准技术鉴定。例如，可按例如H.S.Seifert等，美国国家科学院院报(1986),83,735-739所述使用转座子诱变技术。可以使用各种转座子诱变载体如粘粒cHRIM1，然后筛选失去杀昆虫活性者。这样编码负责毒性的蛋白的DNA区域可以得到鉴定。
例如，可以将小转座子mTn3(HIS3)导入毒性致病杆菌克隆，比如下文称为“克隆1”的cHRIM1，将cHIM1 DNA电穿孔入大肠杆菌RDP146(PLB101)并将此菌株与大肠杆菌RDP146(POX38)融合(mating)，随后与大肠杆菌NS2114 Sm融合。最后的菌株将含有带有转座子mTn3(HIS3)单个插入的cHRIM1 DNA。培养这些克隆落并按下文实施例8所述测试杀昆虫活性。限制酶切作图或DNA测序可用于鉴定mTn3(HIS3)的插入点并由此鉴定参与毒性的DNA区域。相似的方法中可以用其它转座子如TN5和mTn5。
如《分子克隆操作手册》，Maniatis,Fritsch和Sambrook,(1982)，冷泉港所述的，可以使用cHRIM1定点诱变位点测定毒性特异的DNA区段的重要性。
选择性地，亚克隆技术可以用于鉴定编码杀昆虫活性的克隆DNA区域。在此方法中，对特定的DNA小片段进行亚克隆并鉴定其活性。为此，可以用适当的限制性内切酶切割粘粒DNA并连入质粒载体如PUC19上的相容限制性位点。将连接混合物转化入大肠杆菌并用质粒载体上的选择性标志物如编码抗生素抗性的选择性标志物来筛选转化的克隆。这些技术的细节在例如上述Maniatis等的书(见390-391页)以及L.G.Davies,M.D.Dibner和J.F.Battey编的《分子生物学方法》,Elsevier(见第222-224页)中描述。
可以培养含有特定片段的单克隆并按下文实施例8中所述测定活性。带有杀虫活性的亚克隆可以用相同方法进一步截短以进一步鉴定编码活性的DNA区域。
本发明还公开一种分离的杀昆虫剂，其特征在于该制剂来自嗜线虫致病杆菌或其变种的培养物，具有针对大菜粉蝶、小菜粉蝶和菜蛾的口入杀虫活性，高达55℃时基本上热稳定性，是蛋白质，与作为口入杀昆虫剂的苏云金芽孢杆菌细胞协同作用，基本上对胰蛋白酶和蛋白酶K的蛋白水解作用有抗性。
“高达55℃时基本上有热稳定性”是指将悬浮液中的制剂加热至55℃ 10分钟后测试时仍保留一些杀昆虫活性，优选地至少保留未处理活性的50％。
“基本上对蛋白水解作用有抗性”是指制剂在30℃与蛋白酶接触2小时仍保留一些杀昆虫活性，优选地至少保留未处理活性的50％。
“协同作用”是指各成分结合使用的活性大于成分单独使用的期望值。例如，与作为口入杀昆虫剂的苏云金芽孢杆菌结合使用时苏云金芽孢杆菌细胞物质单独使用引起大菜粉蝶50％死亡率所需浓度在与以单独使用时足以引起25％死亡率的浓度的制剂结合应用时降低至少80％。
已发现用30KDa除去滤膜仍保留物质的活性，而用100KDa除去滤膜仅保留部分活性。
优选地，制剂进一步的特性在于，通过于25℃用十二烷基磺酸钠(SDS-0.1％,60分钟)和丙酮(50％,60分钟)处理，杀昆虫活性丧失。
显然，可以利用上述分离制剂的特有特性从致病杆菌细胞和培养基上清液提纯或浓缩制剂。从异源混合物提纯蛋白的方法在本领域众所周知(例如硫酸铵沉淀，蛋白水解，用已知分子量的除去滤膜超滤，分子交换层析、凝胶电泳等)。口入杀昆虫活性提供了测试每阶段后或每个洗脱样本中制剂水平的简便方法。这种方法学不需要本领域技术人员的创造性努力。
本发明进一步公开了包含如上所述的一种或多种制剂的口入杀虫组合物。优选地这样的组合物进一步包含来自非致病杆菌属种类的其它杀昆虫物质。可以选择例如与上述制剂有互补性或与之协同作用的其它物质。
优选地口入杀昆虫组合物含有与苏云金芽孢杆菌(或源自其中的毒素，优选地内毒素)结合的一种或多种上述杀昆虫剂。
编码所述蛋白的重组DNA也构成本发明的另一方面。如技术上已知的，可以将DNA掺入表达载体，并在适当调控元件如启动子、增强子、信号序列等的影响下，这些表达载体构成本发明的另一方面。这些表达载体可以用于转化宿主生物以保证该生物产生此毒素。
本发明可进一步得到包含编码上述杀昆虫剂的核苷酸序列的宿主生物。
克隆编码特性蛋白的序列并导入宿主生物的方法在领域内众所周知。例如，蛋白可以纯化和测序，如果测序不需要活性，可以用SDS凝胶电泳接着凝胶印迹来纯化蛋白。蛋白序列能用来制备核苷酸探针，探针本身可以用于从致病杆菌基因文库中鉴别适当的基因片段。然后将这些片段经适当载体插入能表达蛋白的宿主生物。这些一般技术的使用是常规的，对于本领域技术人员是非创造性的。此技术可以用于制备不同于图2序列所编码的那些致病杆菌毒素。
为了例如优化其物理或毒理学特性，可能需要通过改变其基因序列(及因此改变蛋白质结构)来操作(例如变异)此制剂。
也可能需要对寄主加以设计和选择使它还能表达其它蛋白性杀昆虫物质(例如来自苏云金芽孢杆菌的δ内毒素)。同样可能需要制备能表达由本制剂的活性部分和其它毒性增强物质组成的融合蛋白的宿主生物。
可以选择产生大量杀虫物质以用于纯化的宿主，例如使用用编码杀虫剂的基因转化的苏云金芽孢杆菌。然而优选的寄主是植物，植物将由此得到改善的抗虫性。适当的植物载体如来自根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质质粒在本领域内众所周知。或者，可以选择例如对虫直接致病的宿主，例如昆虫杆状病毒。
本发明的精神和范围包括所有这些宿主生物和它们表达的制剂、变异制剂或制剂融合物质。
因此，本发明提供具有工业上可应用的杀昆虫活性并特别适合于改善农作物保护或昆虫介病毒害控制的方法、组合物、制剂和生物。
现在，本发明的方法、组合物和制剂将以举例说明的方式通过下列非限制性实施例和附图进行描述。对于本领域技术人员，将出现根据本发明的本发明范围内的其它实施方案。附图
图1表示如实施例3所述的嗜线虫致病杆菌ATCC 19061的生长随时间的变化以及细胞和上清液针对大菜粉蝶的活性。
图2表示来自致病杆菌的克隆的毒素基因的大部分序列。
图3表示来自两个致病杆菌菌株的克隆的毒素基因的限制性图谱比较。(上，克隆1；下，克隆3)实施例实施例1-嗜线虫致病杆菌细胞作为口入杀虫剂的应用细胞生长将嗜线虫致病杆菌(ATCC 19061，菌株9965，得自英国国立工业和海洋微生物保藏有限公司，Aberdeen，苏格兰)的传代培养物接种于含50ml LB(Laria Broth)培养基的250ml三角瓶中，其中每升LB含10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5gNaCl。培养物在三角瓶中旋转摇床上于27℃生长40小时。
细胞悬浮液的制备培养物以5000xg离心10分钟，弃去上清液，细胞团洗一次，再悬浮于等体积的磷酸盐缓冲液(每升含8g NaCl,1.44gNa2HPO4和0.24g KH2PO4,pH7.4)中。
细胞悬浮液对昆虫的毒性生物测试如下大菜粉蝶使幼虫在掺入了细胞悬浮液的一系列稀释液的人工琼脂基食物上进食〔如David和Gardiner(1965)所述，伦敦自然杂志，207,882-883〕。生物测试验用5个剂量的系列进行，每剂量至少25只幼虫。测试了未处理和热处理(55℃,10分钟)的细胞。温度保持在25℃，2天和4天后记录死亡率。
埃及伊蚊(Aedes aegypti)幼虫暴露于细胞悬浮液的5个去离子水中的不同稀释度系列中。生物测试使用两个剂量在9.5cm塑料杯中进行，每种稀释度5为0ml细胞悬浮液。每剂量25只二龄期幼虫。测定了未处理和热处理(55℃或80℃,10分钟)的细胞。温度保持在25℃,2天后记录死亡率。
五带淡色库蚊(Culex quinquefaciatus)幼虫暴露于含4×107细胞/ml的单一浓度细胞悬浮液中。生物试验使用2×50ml细胞悬浮液在9.5cm塑料杯中进行，每杯用25只二龄期幼虫。测试了未处理和热处理(55℃或80℃,10分钟)的细胞。温度保持在25℃,2天后记录死亡率。
因此，这些结果清楚表明，嗜线虫致病杆菌作为口入杀虫剂对多种害虫有效(并对大菜粉蝶特别有效)。杀虫活性不依赖于细胞生存力(即加热到55℃使细胞生存力降低了＞99.99％，但对活性无大影响)；但是加热到80℃多数蛋白质变性使活性大大降低。实施例2-嗜线虫致病杆菌上清液作为口入杀虫剂的应用细胞生长培养物生长如实施例1。
上清液制备培养物在10000g下离心10分钟两次除去细胞团。
上清液对害虫的活性生物试验如下按照实施例1中对于大菜粉蝶的方法测试针对新生的大菜粉蝶以及2日龄的大菜粉蝶和菜蛾幼虫的活性，但使用上清液的一系列未处理的稀释液代替细胞悬液，只在4天后记录死亡率
另外，还发现在含有嗜线虫致病杆菌上清液的人工食物上进食的甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)幼虫上测试针对此昆虫的大小减小活性(7日内减小62％)。(结果未列出)。
因此，这些结果清楚地表明来自嗜线虫致病杆菌培养基的上清液作为口入杀虫剂对许多昆虫种类有效，对大菜粉蝶特别有效。
上清液加热到55℃ 10分钟引起活性部分丧失，而加热到80℃引起活性完全丧失。用SDS(0.1％重量/体积，60分钟)和丙酮(50％体积/体积，60分钟)处理也使活性完全丧失，但用TritonX-100(0.1％,60分钟)、非食物的P4O(0.1％,60分钟)、NaCl(1M,60分钟)处理或在4℃或-20℃下冷藏2周对活性无影响。所有这些性质都与蛋白制剂一致。
嗜线虫致病杆菌细胞和上清液的一般作用模式在高剂量下两天之内使幼虫大小减小和死亡和其它性质例如温度抗性表现出相似的暗示即单一制剂或制剂类型可能对细胞和上清液的口入杀虫活性负责。实施例3-出现可吸收的杀昆虫活性的时间表细胞生长1ml嗜线虫致病杆菌的过夜培养物用于接种入三角瓶，然后如实施例1培养细胞。通过在600nm测量光密度来评估生长。
细胞悬浮液和上清的制备如实施例1和2。
细胞和上清液对大菜粉蝶的活性细胞悬液生物测试按实施例1进行，但使用单一剂量细胞悬浮细胞，相当于50μl培养液/g食物，2天后测死亡率。细胞上清液生物测试如实施例2进行，但使用相当于50μl上清液/g食物的单一剂量(即两倍LC50以上)，2天后测死亡率。
结果示于
图1。这些结果清楚地表明来自嗜线虫致病杆菌培养基的细胞作为口入杀虫剂仅5小时后就对大菜粉蝶高度有效，而上清液在20小时后高度有效。虽然在生长早期观察到轻微的细胞溶解作用，但是没有观察到显著的细胞溶解作用，这一点证明，上清液活性可能是由于真正的胞外制剂(而不是细胞破裂后释放的)。实施例4-嗜线虫致病杆菌细胞和苏云金芽孢杆菌粉末制剂之间的协同作用细胞培养和悬浮如实施例1培养和悬浮嗜线虫致病杆菌细胞。苏云金芽孢杆菌菌株HD1(来自芽孢杆菌基因储存中心，俄亥俄州立大学，Columbus,ohio43210，美国)得到培养、收集并制成粉末如Dulmage等(1790)在《无脊椎动物病理学》15,15-20中所述。
嗜线虫致病杆菌细胞和苏云金芽孢杆菌粉末对大菜粉蝶的活性生物测试验使用嗜线虫致病杆菌和苏云金芽孢杆菌(Bt)的组合或单用苏云金芽孢杆菌粉末按实施例1进行，但用苏云金芽孢杆菌粉末不同稀释液代替嗜线虫致病杆菌。在结合试验中，将足以引起25％死亡率的嗜线虫致病杆菌细胞悬浮液的恒定剂量加进食物。2天后记录死亡率。
这些结果清楚地证明，嗜线虫致病杆菌细胞和苏云金芽孢杆菌粉末之间作为口入杀虫剂抵抗大菜粉蝶时的协同作用。实施例5-嗜线虫致病杆菌上清液和苏云金芽孢杆菌粉末之间的协同作用细胞培养和上清液制如实施例2培养嗜线虫致病杆菌细胞并制备上清液。如实施例4培养并处理苏云金芽孢杆菌。
嗜线虫致病杆菌上清液和苏云金芽孢杆菌细胞粉末对大菜粉蝶的活性生物测试用嗜线虫致病杆菌(Xn)上清液和苏云金芽孢杆菌结合进行，或单独用苏云金芽孢杆菌粉末进行。按实施例2针对初生大菜粉蝶及2日龄小菜粉蝶和菜蛾进行生物测试，但用苏云金芽孢杆菌的各种稀释液代替嗜线虫致病杆菌。在结合试验中，将足以引起25％死亡率的嗜线虫致病杆菌上清液加进食物。4天后记录死亡率。
结果清楚证明，当作为针对几种昆虫的口入杀虫剂时嗜线虫致病杆菌上清液和苏云金芽孢杆菌粉末之间的协同作用。嗜线虫致病杆菌细胞和上清液都表现协同作用这一事实强烈表明单一制剂或制剂类型对已证明的活性负责。实施例5-用蛋白水解鉴定来自嗜线虫致病杆菌的杀虫剂细胞培养和上清液的制备按实施例2培养嗜线虫致病杆菌细胞并制备上清液。
上清液的蛋白水解培养物上清液(50ml)逆着0.5M NaCl(3×1升)于4℃透析48小时。透析管中通过用聚乙烯乙二醇8000(Sigma试剂)覆盖使上清液体积减少5倍。取出样品并用胰蛋白酶(SigmaT8253=10,000单位/mg)或蛋白酶K(Sigma P0390=10单位/mg)以0.1m蛋白酶/ml样品浓度，于30℃处理2小时。
蛋白酶处理的上清液对大菜粉蝶的活性通在4.5cm直径塑料瓶中，用25μl每“处理”涂于实例1所用的人工琼脂基食物上来进行针对大菜粉蝶初生幼虫的生物测试。每处理使各含10只幼虫的4个瓶子。1和2天后记录死亡率。只用水、胰蛋白酶(0.1g/ml)和蛋白酶K(0.1mg/ml)的对照用相同方法处理。<
实施例6-其它致病杆菌的杀昆虫活性用实施例1和2的方法测试4个不同致病杆菌菌株针对昆虫虫害的活性。所得结果如下Ⅰ)对大菜粉蝶的活性<
发现，所有4个菌株的细胞和上清液加热到80℃ 10分钟时杀昆虫活性减少99％以上。
Ⅱ)对蚊子(Aedes aegypti)的活性细菌按10上7细胞/ml水的比率加入。
另外，所有菌株都明显减弱烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的生长。
实施例7-从致病杆菌菌株克隆毒素基因用Quiagen基因组纯化DNA试剂盒从NCIMB 40887和ATCC19061分离细胞总DNA。细胞在LB培养液(每升含10g胰蛋白胨，5g酵母提取物和5g NaCl)中于28℃振荡(150rpm)培养至光密度1.5(A600)。通过4000×g离心收集培养物并重新悬浮于3.5ml缓冲液B1(50mM Tris/HCl,0.05％ Tween 20,0.5％ Triton X-100,pH7.0)并于50℃温育30分钟。利用Quiagen 100/G吸管按照厂商说明书从细菌溶菌产物分离DNA。获得的纯化DNA在-20℃存于TE缓冲液(10mMTris,1mM EDTA,pH8.0)中。
用限制性酶Sau 3A部分消化的NCIMB 40887和ATTC 19061的总DNA制备代表性的DNA文库。来自每个菌株的约20μg DNA在37℃与0.25单位酶一起温育。在10,20,30,45和60分钟的时间间隔取样并加热至65℃ 15分钟。为了观察DNA片段的大小，将样品在0.5％重量/体积琼脂糖凝胶上电泳。合并含有最高比率的30至50kb片段的DNA样品，用4单位虾碱性磷酸酶(Boeh ringer)于37℃处理15分钟，然后65℃热处理使磷酸酶失活。
将选择大小的DNA片段插入粘粒载体SuperCosl(Stratagent)的BamH1位点中并用GigapackⅡ包装试剂盒(Stratgene)按照厂商说明包装入大肠杆菌XL Blue1菌株。
为了选择具有杀虫活性的粘粒克隆，在含有25μg/ml氨苄青霉素的L琼脂平板上选择的单克隆在LB培养液(含25μg/ml氨苄青霉素)上于28℃生长过夜。如实施例5中所述，分别将培养物(50μl)涂布到装在4.5cm直径瓶中的昆虫食物表面。每个容器中加入10只初生大菜粉蝶幼虫。24,72和96小时之后检查幼虫，记录死亡率和存活幼虫大小。总共220个NCIMB 40887克隆得到测试，发现其中2个引起72小时内幼虫生长减弱和死亡。ATTC 19061的370个克隆中发现一个在72小时内引起幼虫死亡。实施例8-克隆的毒素基因对大菜粉蝶的活性来自实施例7的三个活性克隆在含25μg/ml氨苄青霉素的LB养液中150rpm旋转摇床上于28℃生长24小时。如实施例1所述，通过将完全液体培养物掺入昆虫食物进行毒素克隆对初生幼虫的活性测试。
*大肠杆菌XL1Blue培养液当将大肠杆菌毒素克隆于80℃加热10分钟并以100μl/g比率加进食物时，未测到对幼虫的活性。毒素的热敏感性突出。实施例9-来自NCIMB 40887的毒素克隆的测序用Wizard Plus SV DNA系统(promega)按照厂商说明从NCIMB40887提纯上述杀昆虫克隆1的粘粒DNA。如图3所示，使用一系列限制酶ECoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ和SacⅠ获得克隆片段的部分图谱。DNA测序从用一系列限制酶ECoRⅠ、BamHⅠ、Hind Ⅲ、ECoRⅤ和PvuⅡ制备的以PUC18和PUC19为基础的粘粒亚克隆开始。序列空隙用在纯化的粘粒DNA上的引物步移法补充。测序反应用带有Ampli TaqDNA多聚酶FS的ABI PRISMTM染料终止循环测序反应备好试剂盒按照厂商说明进行。样品在ABI自动测序仪上按厂商说明进行分析。克隆的毒性片段的大部分DNA序列示于图2。实施例10-来自克隆3的毒克隆素的限制性图谱按实施例9中所述纯化上述杀昆虫克隆3的粘粒DNA。克隆片段的限制性图谱使用限制性酶BamHⅠ、HndⅢ、SalⅠ和SacⅠ获得并在图3中表示。与克隆1的图谱(图3)比较，显然覆盖重叠区域的限制性图谱是很相似的。两个克隆之间唯一可检测到的差别是克隆了中两个HindⅢ片段的长度缩短，对应于克隆1中11.4Kb和7.2Kb HindⅢ片段，分别为约2Kb和200bp。这些结果表明在两个细菌菌株中的编码毒性的DNA区域是完全相关的。
实施例11-Southern Blot杂交试验来自克隆1的10.3Kb BamHⅠ-SalⅠDNA片段用作探针来与用HindⅢ消化的致病杆菌菌株ATCC 19061,NCIMB 40886和NCIMB40887的总DNA杂交。杂交用20ng/ml DIG(洋地黄毒苷)标记的DNA探针在65℃进行18小时。免疫测试之前，滤纸用2×SSC(0.3M NaCl,30mM柠檬酸钠，pH7.0)/0.1％(重量/体积)十二烷基磺酸钠在室温下洗两次，每次5分钟；再用0.1×SSC(15mM NaCl,1.5mM柠檬酸钠，pH7.0)加0.1％十二烷基磺酸钠在65℃下洗两次，每次15分钟。使用非放射性DIGDNA标记和检测试剂盒(Bochringer)按照厂商说明标记探针。探针与所有三个菌株中的约8Kb HindⅢ片段和NCIMB 40887中的11.4Kb片段以及NCIMB 40886和ATCC 19061中的约9Kb的片段杂交。结果表明，菌株NCIMB 40886和ACTT 19061含有与上述克隆1的毒素基因密切同源的DNA，进一步证明由三个菌株产生的毒素之间的相似性。
权利要求
1．一种适于从口施用于昆虫的杀昆虫组合物，包括可从致病杆菌属种类获得的杀昆虫物质或其杀昆虫片段或它们的杀昆虫变体或衍生物。
2．根据权利要求1所述的组合物，其中所述的杀昆虫物质包括由图2的核苷酸序列或其变体或片段或与该序列杂交的序列编码的物质。
3．根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，包含致病杆菌细胞。
4．如上述权利要求中的任意一项所述的组合物，包含来自致病杆菌属种类的细胞培养物的上清液。
5．根据上述权利要求中的任意一项所述的组合物，其中致病杆菌属种类是嗜线虫致病杆菌。
6．根据权利要求1至4中的任意一项所述的组合物，其中致病杆菌菌株是ATCC 19061、NCIMB 40886或NCIMB 40887。
7．根据上述权利要求中的任意一项所述的组合物，包含不是从致病杆菌获得的其它杀昆虫物质。
8．根据权利要求7所述的组合物，其中所述的其它杀昆虫物质包括可从苏云金芽孢杆菌获得的物质。
9．根据权利要求8所述的组合物，进一步包括苏云金芽孢杆菌细胞。
10．根据权利要求8所述的组合物，其中可从苏云金芽孢杆菌获得的杀昆虫物质包括δ内毒素。
11．根据上述权利要求中的任意一项所述的组合物，进一步包含农业上可接受的载体。
12．根据权利要求10所述的组合物，其中载体包括各种昆虫食物。
13．一种杀灭或控制昆虫虫害的方法，此方法包括向害虫或其环境施用根据上述权利要求中的任意一项所述的组合物。
14．如权利要求13所述的方法，其中害虫是鳞翅目或双翅目昆虫。
15．一种微生物，包括致病杆菌菌株NCIMB 40886。
16．一种微生物，包括致病杆菌菌株NCIMB 40887。
17．一种含有毒素的杀昆虫剂，其中毒素包括由DNA编码的蛋白，所述DNA包括SEQ ID No.1或其变体或片段。
18．一种分离的杀昆虫剂，其特征在于它可从嗜线虫致病杆菌或其突变体的培养物得到，具有针对大菜粉蝶、小菜粉蝶和菜蛾的口入杀虫活性，高达55℃基本上是热稳定的，是蛋白质，与作为口入杀昆虫剂的苏云金芽孢杆菌协同作用，以及对胰蛋白酶和蛋白酶K的蛋白水解作用基本上有抗性。
19．如权利要求18中所述的分离杀昆虫剂，其进一步特征在于用十二烷基磺酸钠或丙酮处理或加热至80℃时杀虫活性基本上遭到破坏。
20．如权利要求18或19所述的分离杀昆虫剂，其进一步特征在于该杀昆虫剂是细胞外蛋白质。
21．一种重组DNA，编码根据权利要求17至20中的任意一项所述的杀昆虫剂。
22．根据权利要求21所述的重组DNA，包含图2的序列或其变体或片段。
23．一种重组DNA，编码杀虫物质，含有所有或部分图2序列，或在严格条件下与所有或部分图2序列杂交。
24．一种表达载体，含有根据权利要求21至23中的任意一项所述重组DNA。
25．用根据权利要求24所述的表达载体转化的宿主生物。
26．如权利要求25所述的宿主生物，此宿主生物经加工或选择从而也表达其它杀昆虫蛋白活性增强物质。
27．一种包含融合蛋白的核苷酸序列的宿主生物，融合蛋白包含与其它蛋白毒性增强物质结合的根据权利要求17至20中的任意一项所述的制剂的杀昆虫活性部分。
28．权利要求27所述的宿主生物，其中杀虫活性增强物质包括来自苏云金芽孢杆菌的δ内毒素。
29．如权利要求25至289中的任意一项所述的宿主生物，其中宿主是植物。
30．如权利要求25至28中的任意一项所述的宿主生物，其中宿主是针对昆虫的致病病毒。
31．由如权利要求27所述的宿主表达的融合蛋白。
32．一种杀昆虫组合物，包括权利要求17至20中的任意一项中所述的一种或多种制剂。
全文摘要
一种杀灭害虫(例如昆虫)的方法,包括将来自致病杆菌属(Xenorhabdus)种类(例如嗜线虫致病杆菌X·nematophilus)的物质如细胞或上清液单独,或与苏云金芽抱杆菌 (Bacillus thuringiensis)或从其衍生的杀昆虫物质相结合经口施用于害虫。还公开了一种分离的杀昆虫剂(以及含有此杀昆虫剂的组合物),其特性在于可从嗜线虫致病杆菌或其突变体的培养物获得,具有针对大菜粉蝶(Pieris brassicae)、小菜粉蝶(Pieris rapae)和菜蛾(Plutella Xylostlla)的口入杀虫活性,而且高达55℃时基本上是热稳定的,并且是蛋白质,与作为口入杀昆虫剂的苏云金芽孢杆菌细胞协同作用,以及对胰蛋白酶和蛋白酶K的蛋白水解作用基本上有抗性。还公开了编码杀昆虫活性的DNA。
文档编号A01N63/02GK1233938SQ9719891
公开日1999年11月3日 申请日期1997年8月27日 优先权日1996年8月29日
发明者P·扎里特, D·J·艾利斯, J·A·W·莫冈 申请人:英王陛下的大不列颠及北爱尔兰联合王国政府农业渔业和食品部