一种牛大力组培苗瓶内结薯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种牛大力组培苗瓶内结薯的方法。
【背景技术】
[0002] 牛大力为豆科鸡血藤属植物美_鸡血藤（Callerya speciosa Champ.)，又名大力 薯、山莲藕，始载于《生草药性备要》，是《广西中药材标准》（1990年版）收载的地方药材。 牛大力以根入药，味甘，具有补虚润肺、强筋活络的功效，临床证明其对腰肌劳损、风湿性关 节炎、肺虚咳嗽、肺结核、慢性支气管炎、慢性肝炎等慢性疾病有较好的疗效。壮族民间常用 于腰腿痛、风湿骨痛、肺结核、慢性肝炎及慢性胃炎的治疗。
[0003] 现代研宄发现，牛大力含有多糖、生物碱、香豆素和多种微量元素等成分，其中牛 大力多糖是其主要活性成分，是理想的免疫增强剂，具有调节免疫系统、抗氧化、抗炎、抗肿 瘤活性，尤其是抗肿瘤方面疗效明确，目前临床研宄显示其对鼻咽癌、卵巢癌、肺癌以及结 肠癌具有良好的治疗效果；生物碱和香豆素具有保肝、祛痰、镇咳、镇痛、镇静、解痉的作用， 且对正常细胞均没有毒副作用，在开发抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等药物方面有着特殊的优 势，已成为提取企业竞相开发的新目标，市场需求量巨大。自20世纪70年代起，作为主要原 料被制药企业加工成壮腰健肾丸、强力健身胶囊、桂龙药膏、活络止痛丸、强力追风透骨丸、 舒筋健腰丸、益智康脑丸、抗风湿液等中成药，在全国广泛应用。近年来，牛大力又成为提取 企业竞相开发的新目标，提取多糖和高丽槐素等成分。
[0004] 随着牛大力需求量的不断增加，野生资源已经枯竭，原材料严重供不应求。为了 解决供需矛盾，人们尝试采用人工栽培的方法扩大药源，目前已发现有一些成功的研宄报 道。牛大力组织培养方面，以茎段为外植体的污染率比以种子为外植体的高，且成苗经 过愈伤组织，组培周期长，容易引起变异。王祝年等以成熟果荚（种子）为外植体进行 组织培养快速繁殖牛大力，种子萌发培养基为1/2MS，芽的增殖与继代培养基为MS+6-BA 2. Omg ?P+NAAO. 5mg ?L-1，生根培养基为1/2MS+IBA1. Omg ?L-1，将种子萌发的无菌苗切段 接种到增殖培养基上，经过愈伤组织形成不定芽，容易引起变异，40d平均增殖系数达5. 0， 生根培养20d，生根率达80%。目前普遍存在牛大力组培苗不结薯或者结薯能力远远比不 上种子苗的问题，为了解决这个问题，申请人对组培苗瓶内结薯开展了研宄，目前仍未发现 在牛大力试管苗生根的同时实现试管苗结薯的文献报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优 点。
[0006] 本发明还有一个目的是提供一种诱导培养基及牛大力芽苗的诱导培养方法和炼 苗移栽的方法，使牛大力芽苗在组培苗瓶内结薯，克服了牛大力组培苗出现不结薯或者结 薯能力远远比不上种子苗的问题。
[0007] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种牛大力组培苗瓶内 结薯的方法，将牛大力芽苗置于诱导培养基中进行诱导培养管理使在组培瓶内生根及 结薯，所述诱导培养基的配方为：l/4-l/2MS、l. 5-2. 5mg ? 2-0. 8mg ? L4ABA、 1. 0-2. 5mg *LiBRJ-lS ymol*LijAdSO-SSOmg*LipVP、。.8-1. 5mg *L 1 核黄素、35_45g *L 1 蔗糖和3-8g ? I71琼脂。
[0008] 优选的是，所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养基的配方为： 1/2MS、2.Omg .I^IBA'O. 5mg .I^ABA、〗.Omg ymol .I^JA'SOOmg .I^PVP'l. Omg .I71 核黄素、40g ? L-1蔗糖和5g ? L-1琼脂。
[0009] 优选的是，所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养基的制备方法 为：
[0010] 先按照所述诱导培养基的配方称取蔗糖与琼脂，煮沸溶解，再按所述诱导培养基 的配方添加1/2MS、IBA、ABA、BR、PVP和核黄素，于121°C灭菌20min，在超净工作台上冷却 至50°C，之后按照所述诱导培养基的配方添加过滤灭菌后的JA，分装成25-30ml/瓶，冷却 凝固后备用，所述过滤灭菌是指将JA通过孔径为0. 22 y m的膜过滤。
[0011] 优选的是，所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养管理具体是指将 置有牛大力芽苗的诱导培养基置于温度为24-28°C、光照强度为700-900LX、光照时间为 9-llh/d的条件下培养23-27d。
[0012] 优选的是，所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述诱导培养管理之后进行炼 苗移栽，具体是指牛大力芽苗在组培瓶内培养23-27d至生根及结薯后，移到炼苗棚进行开 盖炼苗，4d后用镊子将瓶苗取出，用清水洗去粘附在根部的培养基，移栽到混合基质上，移 栽后第1-10(1内控制相对湿度为92%-97%，温度白天控制在23-25°〇，夜间15-18°〇，移栽 第15d后再转移到培养杯种植，在培养杯中种植15d后进行大田栽培，其中所述混合基质由 椰糠和细河沙组成，且椰糠的含量占所述混合基质含量的质量百分数为60% -80%。
[0013] 优选的是，所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述混合基质中椰糠的含量为 75%。
[0014] 优选的是，所述的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，所述牛大力芽苗是牛大力继代 增殖芽苗长至2cm以上，从基部切下得到的单个芽苗，具体包括以下步骤：
[0015] 步骤一、外植体灭菌：取牛大力成熟黑色种子，用体积百分浓度为0.05%洗洁精 溶液浸泡l〇min，经流水冲洗15min，在超净工作台上用0. 1%取(：12溶液灭菌16min，然后 用无菌水摇荡洗涤4次，再用无菌吸水纸将水分吸干后进行初代培养；
[0016] 步骤二、初代培养：将步骤一种灭菌好的种子接种至初代诱导培养基上进行种 子萌发及丛生芽诱导培养，在温度为24-28°C、光照强度为2000Lx、光照时间为10h/d的 条件下培养20-25d，所述初代诱导培养基的配方为：MS、3. Omg ? Ll-BAU. 5mg ? LlT、 0. 2mg ? PNAA和500mg ? I^PVP ;所述初代诱导培养基附加30g ? L-1鹿糖和5g ? L-1琼脂， pH6. 0,配制分装后，于121°C灭菌20min ;
[0017] 步骤三、继代增殖：将步骤二中初代诱导培养获得的丛生芽切下含2-3个芽的芽 丛转接到继代培养基上进行增殖培养，在温度为24-28°C、光照强度为2000LX、光照时间为 l〇h/d的条件下培养20-25d，所述继代培养基的配方为：MS、2. Omg ? L-i-BA、。. 5mg ? LlT、 0. 2mg ? LlDZ和0. 2mg ? L，AA ;所述继代培养基附加30g ? L-1蔗糖和5g ? L ―1琼脂，pH6. 0， 配制分装后，于121°C灭菌20min。
[0018] 本发明提供的牛大力组培苗瓶内结薯的方法，在组培过程中使牛大力芽苗生根并 结薯，有效解决目前普遍存在的牛大力组培苗不结薯的问题，且本发明的方法操作简便，生 产成本低，牛大力芽苗增殖速度快，生根移栽成活率高，便于大规模工业化生产应用。
[0019] 本发明至少包括以下有益效果：
[0020] 第一、在诱导培养基中添加IBA与核黄素用以促进牛大力在组培瓶内生根，添加 ABA、BR、JA促进牛大力在组培瓶内结薯，而PVP有利于降低褐化程度从而利于牛大力在组 培瓶内生根结薯，同时本发明的诱导培养基配方通过以上浓度的物质配比在提高诱导培养 基渗透压的同时，促进牛大力在组培瓶内生根并结薯；
[0021] 第二、高压灭菌时JA容易分解，故采用过滤灭菌方式后添加到诱导培养基中，以 确保JA的有效性；
[0022] 第三、确定了适宜于牛大力芽苗移栽的混合基质，即椰糠与细河沙的质量比为 3 : 1时，牛大力芽苗移栽的生长状况最好；
[0023] 第四，本发明的牛大力组培苗瓶内结薯的方法以高质量的无菌苗作为培养材料才 能或得高的生根结薯率，本发明的牛大力培养材料选用牛大力种子经外植体灭菌、初代培 养和继代增殖至牛大力芽苗长至2cm以上，从基部切下得到的单个芽苗，有利于牛大力组 培苗瓶内结薯。
[0024] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过