一种减轻植物组培外植体褐化的衣膜包囊培养法
【技术领域】
[0001] 本发明属农林领域的植物组织培养技术，具体涉及降低植物组培外植体初代培养 褐化率的方法。
【背景技术】
[0002] 植物组织培养技术种苗生产、脱除病毒、种质改良等具有广阔的市场前景。目前 植物组织培养技术环节还存在不少问题，外植体(种子、芽、茎段、叶、根、花瓣、果实等）初代 诱导期间褐化死亡是制约组织培养成功的瓶颈。其原因为：离体组织或器官切口细胞所含 酚类物质在空气(氧气）中酶促反应成醌类物质，后者再通过非酶促反应产生有色物质而导 致组织褐化并扩散，抑制细胞其它酶的活性，影响细胞的正常代谢，导致整个组织死亡。 褐化在木本植物、多年生植物、热带植物等体内单宁类和羟酚类化合物含量高的植物尤其 明显。克服外植体褐化的方法主要有：选择适当的外植体采集季节和部位；接种前用抗氧 化剂短时间浸泡外植体；培养基添加抗褐化剂(抗氧化剂、抗氧化酶活性促进剂和酚类物质 吸附剂）；外植体热激处理（45-50°C抑杀多酚氧化酶、苯并氨酸酶)，培养物多次转移到新鲜 培养基，如专利公布号 CN 103250645 A、CN 102986534、CN 102986533、CN 103004754 A、 CN 102805032 A、 CN 102823490 A、 CN 102577953 A、 CN 103125380 A、 CN 102318560 A、 CN102860255A、CN 102115727 A、CN 103202233 A、、CN 103004602 A、CN 102870677 A、CN 101148653、CN 1737142、CN1742564等。这些方法针对外植体褐化某一因素或只是被动的 方法，效果都有局限性。
【发明内容】
[0003] 本发明以衣膜(混合抗褐化齐[J、营养、激素成分）包囊整个组培外植体再接种到培 养基培养，衣膜透水、透气、透光，对植物组织没有明显伤害，细胞呼吸不受影响，培养基营 养及激素能被外植体吸收不受影响。相对常规的抗褐化剂使用方法，优越性为（1)衣膜包 囊整个外植体培养，扩大了外植体与抗褐化剂的接触作用的面积和时间；（2)衣膜包囊整 个外植体，隔绝了大部分空气，减轻细胞酚类物质被酶促氧化成醌类物质而毒害组织细胞；
[3] 采用40°C _45°C卡拉胶包囊，热激外植体降低褐化相关酶活性，减轻褐化，提高外植体 培养成活率。
[0004] 一种减轻植物组培外植体褐化的包囊培养法，其特征在于，包囊外植体所采用的 成膜剂配成的衣膜不与培养基成份起反应，透气、透水性好，耐高压灭菌，凝固的衣膜透光 性好，对植物细胞伤害小，本发明采用海藻酸钠或温热卡拉胶为成膜剂，附加成分包括抗褐 化剂、营养成分、激素。营养成分、激素、酸碱度依照外植体培养基所采用配方和酸碱度，抗 褐化剂在成膜剂酸碱度下有抗氧化能力，一般为弱酸性包括抗坏血酸、半胱氨酸盐、柠檬 酸、亚硫酸氢钠、硫脲，可选一种或一种以上组合。
[0005] 本发明提供的技术方案如下： 衣膜剂各组分含量：所述的成膜剂海藻酸钠浓度2%-5%，或卡拉胶浓度0. 5-0. 7%。海 藻酸钠交联固化剂为2%氯化钙溶液。抗褐化剂浓度：抗坏血酸10-300mg/L、半胱氨酸盐 10-300mg/L、柠檬酸10-300mg/L、亚硫酸氢钠10-300mg/L、硫脲10-300mg/L，一种或几种组 合。
[0006] 海藻酸钠衣膜剂配制、使用方法：海藻酸钠先用少量水溶化，耐高压灭菌的抗褐化 剂柠檬酸、亚硫酸钠、硫脲用少量水溶化，耐高压灭菌的营养成分、激素按常规方法配成水 溶液，上述组分混合，用水定容，调pH与培养基相同，高压灭菌，得粘稠液冷却待用。抗坏血 酸、半胱氨酸盐溶液及不耐高压灭菌的营养成分、激素分别过滤除菌，加入已经高压灭菌的 海藻酸钠衣膜剂，搅拌混匀待用。氯化钙单独高压灭菌。接种前将已经表面消毒的外植体 泡入海藻酸钠衣膜剂，取出轻轻抖掉多余衣膜剂粘稠液，投入氯化钙溶液，固化数分钟，取 出投入无菌水洗去多余氯化钙，在无菌滤纸上吸去无菌水，接种时轻压外植体包囊使其稍 陷入琼脂培养基里。
[0007] 卡拉胶衣膜剂配制、使用方法：0.5-0. 7%卡拉胶先用少量热水溶化，耐高压灭菌 的抗褐化剂柠檬酸、亚硫酸氢钠、硫脲用少量水溶化，耐高压灭菌的营养成分、激素按常规 方法配成水溶液，上述组分混合，用水定容，调pH与培养基相同，高压灭菌。抗坏血酸、半胱 氨酸溶液及不耐高压灭菌的营养成分、激素分别过滤除菌，加入未冷凝的卡拉胶衣膜剂粘 液，搅拌混匀，调pH至与经高压灭菌培养基酸碱度相同（一般pH5. 6)，自然冷却到45-50°C 包囊外植体，卡拉胶衣膜剂也可室温保存，包囊时加热到45-50°C溶化，在超净工作台将经 表面消毒的外植体投入卡拉胶衣膜剂粘稠液，取出轻轻抖掉多余粘稠液，晾干凝固。接种时 轻压外植体包囊使其稍陷入琼脂培养基里。
[0008] 本发明的有益效果在于：一般的防止外植体褐化方法，接种前用抗褐化剂浸泡外 植体，褐化剂作用时间短，也有将抗褐化剂加入到琼脂培养基，外植体接种于培养基表面， 与抗褐化剂接触面积小，本发明将含抗褐化剂的衣膜剂包囊整个外植体进行接种培养，扩 大抗褐化剂作用面积，延长作用时间，而且衣膜包囊整个外植体，能显著隔绝外植体与空气 接触，极大减轻组织细胞酶促氧化而褐化死亡，45-5CTC卡拉胶粘液包囊外植体，还能抑杀 多酚氧化酶及苯丙氨酸酶，减轻褐化，提高组培外植体成活率。此外由于衣膜剂含与培养基 相同的营养和激素成分，保证外植体诱导的正常进行。上述因素的综合作用，明显减轻植物 组培外植体褐化程度，提高成活率，为外植体诱导成功提供保障。该方法操作简便，成本低 廉，效果明显，便于推广应用。
[0009]
【具体实施方式】[0010] 实施例一 蝴蝶兰)叶切块流水冲洗30分钟以上，在超净台用75%乙醇浸泡 30秒钟，无菌水洗涤2次，2%次氯酸钠浸泡30分钟，无菌水漂洗3次，滤纸吸干表面水分， 切成小块外植体，对照组外植体直接接种，培养基成分l/2MS+6-BA5mg/L+NAA0. 2mg/L+椰 子汁20% (V/V) +蔗糖20g/L，pH 5.8。衣膜包囊外植体方法，海藻酸钠浓度3%，附加抗褐 化剂亚硫酸钠终浓度l〇〇mg/L，营养、激素成分同上述的培养基成分，调pH至5. 8,高压灭 菌后冷却待用，另2%氯化钙高压灭菌待用。接种时将已经消毒的外植体泡入海藻酸钠衣膜 齐U，取出轻轻抖掉多余粘稠液，投入氯化钙溶液，固化3分钟，取出投入无菌水洗去多余氯 化钙，在无菌滤纸上吸去无菌水。接种时包囊衣膜的叶片外植体平放，下压使叶片稍陷入培 养基。每瓶接种6个外植体，每次5瓶，重复3次。接种后在25°C、15001ux光下培养，光照 12h/d，结果见表1。
[0011] 表1蝴蝶兰叶切块的衣膜包囊外植体培养法效果观察*
【主权项】
1. 一种减轻植物组培外植体褐化的衣膜包囊培养法，其特征在于：由成膜剂混溶抗褐 化剂、营养成分、激素所得衣膜剂粘液透气透水、基本无色透明，成膜剂可以是海藻酸钠，经 表面消毒的外植体浸入海藻酸钠溶液，取出表面沾粘有衣膜剂的外植体投入氯化钙溶液固 化，接种培养；成膜剂也可以是温热卡拉胶粘液，浸入经表面消毒的外植体后取出自然冷 却，固化后接种培养。
2. 如权利要求1所述的减轻植物组培外植体褐化的衣膜包囊培养法，其特征在于：所 述的海藻酸钠浓度为2%-5%。
3. 如权利要求1所述的减轻植物组培外植体褐化的衣膜包囊培养法，其特征在于：所 述的氯化钙浓度2%，高压灭菌。
4. 如权利要求1所述的减轻植物组培外植体褐化的衣膜包囊培养法，其特征在于：所 述的卡拉胶用温水配制0. 5%-0. 7%溶度，高压灭菌，45°C -50°C的粘液用于包囊外植体。
5. 如权利要求1所述的减轻植物组培外植体褐化的衣膜包囊培养法，其特征在于：所 述衣膜剂的营养成分，激素、酸碱度与培养基所的营养成分、激素、酸碱度一致。
6. 如权利要求1所述的减轻植物组培外植体褐化的衣膜包囊培养法，其特征在于： 所述的抗褐化剂在成膜剂酸碱度下有抗氧化能力，包括以下一种或数种组合：抗坏血酸 10_300mg/L、半胱氨酸盐10_300mg/L、梓檬酸10_300mg/L、亚硫酸氢钠10_300mg/L、硫脲 10-300mg/L〇
7. 如权利要求1所述的减轻植物组培外植体褐化的衣膜包囊培养法，其特征在于：抗 褐化剂柠檬酸、硫脲及耐高压灭菌的营养成分、激素混溶于海藻酸钠或卡拉胶一起高压灭 菌，抗褐化剂抗坏血酸、半胱氨酸盐、亚硫酸氢钠及不耐高压灭菌营养成分、激素过滤除菌， 加入经高压灭菌海藻酸钠或卡拉胶粘液混溶。
【专利摘要】本发明公开了一种在植物组培中以含抗褐化剂的衣膜剂包囊外植体以减轻外植体褐化的方法，属农林领域的植物组织培养技术。包括以透气、透水、透光性好、对植物组织安全的衣膜剂包囊外植体方法。衣膜剂由成膜剂混溶抗褐化剂及与培养基成分一致的营养成分、激素，衣膜剂可以是海藻酸钠溶液，包囊后以氯化钙溶液交联固化，衣膜剂也可以是45-50℃卡拉胶溶胶，包囊外植体后冷却固化。本发明以衣膜剂包囊外植体，扩大了外植体与抗褐化剂的接触面积，隔绝空气、或热激效应而有效抑制褐化，降低外植体培养死亡率。该方法操作简便，成本低廉，效果明显，便于推广应用。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104521763
【申请号】CN201510033463
【发明人】刘福平
【申请人】福建省亚热带植物研究所
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月23日