专利名称：一种牡丹组培苗增殖及褐化和玻璃化防止方法
技术领域：
本发明涉及植物种苗繁殖技术，具体地说涉及一种牡丹组培苗增殖及褐化和玻璃化防止方法。
背景技术：
牡丹是我国特产的传统名花，我国人民历来视牡丹为中华民族繁荣昌盛、兴旺发达、和平幸福的象征。近年来，牡丹在美化环境、商品生产、社会文化方面的应用越来越广泛，这需要以大量的牡丹苗木为基础，而牡丹只有单瓣品种结实多，半重瓣品种次之，重瓣品种一般不结实，且实生苗变异大，不易保持母株优良性状。另外，嫁接、分株等传统繁殖方式以及近几年出现的双平法繁殖，也都需要大量的砧木、接穗、植株等原始繁殖材料，因此繁殖速度也不快，无法满足社会的需要。
组织培养是植物快速繁殖的最有效手段之一，可以在短期内提供大量的优良无性系苗木和繁殖材料。近二十年来，国内外许多学者都致力于牡丹组织培养的研究。以芽为外植体的牡丹组培报道中，普遍认为早春时期即将萌动的休眠芽是最好的材料；MS或改良的MS基本培养基是适宜的培养基；激素BAP与GA3配合使用可以生长良好且获得较高的增殖率；钙离子浓度加倍对防止外植体玻璃化，提高有效增殖率有益。由于牡丹的品种众多品种间的差异较大，组培时不同的品种需要分别对待，更加剧了组培的难度。总之在牡丹组培中，各种品种普遍表现出繁殖系数低，褐化、玻璃化严重等问题。据报道，牡丹组培中各种品种的增殖率普遍较低，一般在3.0左右，也就是说增殖率还有待进一步提高；同时，组培苗的玻璃化，导致组培苗的畸形、病态，降低了苗的质量和增殖率；而褐化的发生，对组培苗产生毒害，导致死亡，也降低了组培苗的增殖率。因此，围绕提高增殖率以及如何防止玻璃化和褐化的问题一直是牡丹组培技术发展的瓶颈。只有解决好它们，才能攻破牡丹组织培养这一技术难题。
发明内容
(一)、要解决的技术问题本发明的目的在于提供一种牡丹组培苗增殖及褐化和玻璃化防止方法。
(二)、技术方案本发明为一种牡丹组培苗增殖、褐化和玻璃化防止方法，所用的培养基为基本培养基+BAP 0.5-1.0mg/L+GA30.2-1.0mg/L。
本发明所述的培养基，其中用于增殖时所述的基本培养基为MS培养基、Ca2+加倍。
本发明所述的培养基，用于防止褐化时所述的基本培养基为改良MS培养基。
本发明所述的培养基，其中用于防止褐化时所述的改良MS培养基为1/2～1/3微量元素、Ca2+加倍，CaCl2与Ca(NO3)2的摩尔比为1∶1。
本发明所述的培养基，其中用于防止玻璃化时所述的基本培养基为改良MS培养基。
本发明所述的培养基，其中防止玻璃化时所述的改良MS培养基为1/2大量元素、Ca2+加倍，CaCl2与Ca(NO3)2的摩尔比为1∶1。
(三)、有益效果试验中通过对激素浓度的筛选，得到了适合不同品种增殖的最佳激素浓度，普遍提高了这些品种的增殖率，尤其是对于纯黄色、香气怡人的品种‘正午’，已将它的增殖率提高到8.00，在牡丹组培技术上又迈进了一步。
研究表明，调整了MS基本培养基中一些元素的用量，发现对减轻牡丹组培苗的玻璃化和褐化现象有明显的作用，在含有1/2大量元素的改良MS基本培养基上，‘乌龙捧盛’和‘明星’两品种的玻璃化苗比率都最低，尤其是后者，完全没有玻璃化苗的出现，大大提高了牡丹组培苗的质量和实际增殖率，为尽快克服牡丹组培难题提供了保证。
一般认为微量元素参与酶活性的变化从而影响植物组织的褐化，本发明发现与微量元素相比，大量元素对褐化的影响作用更大；大量元素减少，褐化加重，推测是因为抑制了组培苗的生长，从而影响了植物内部的生理机能。在改良MS培养基上，‘乌龙捧盛’的褐化情况，93％表现为1级，‘明星’83％表现为1～2级，均较轻，可以认为没有发生褐化。微量元素的含量也影响褐化，‘乌龙捧盛’和‘明星’分别在含1/2和1/3微量元素的培养基上褐化最轻。褐化的减轻，减少了有毒物质对组培苗的伤害，为组培苗正常、健康的生长提供了有力的保证。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 增殖培养基以MS(Ca2+加倍)为基本培养基，蔗糖40g/L，琼脂6g/L，PH值5.8，附加激素是‘正午’BAP1.0mg/L，GA30.2mg/L；‘乌龙捧盛’BAP0.5mg/L，GA30.5mg/L；‘明星’BAP0.5mg/L，GA31.0mg/L；‘珊瑚台’BAP1.0mg/L，GA30.5mg/L；‘紫二乔’BAP1.0mg/L，GA30.5mg/L。
用早春即将萌动的休眠芽为外植体，消毒灭菌后剥去芽鳞，切掉芽内小叶片，将剩余部分接种在培养基上培养，每7天观察统计一次，记录各种品种在不同培养基上的增殖率及生长状况。培养5周后进行继代，方法是自组培苗叶柄基部切去叶片，再沿茎的中轴纵切，在有新芽发生的部位的下方0.5厘米处横切，将得到的部分接种在新的培养基上培养(以后的继代过程相同)，共进行3次继代培养，观察统计方法同初代培养。培养条件为室温25℃，光照时数14h/d，光强2000Lx。
表1 牡丹组培苗生长情况
*表中所列的茎高是3次继代过程的平均值。
**表中所列的增殖率为第II次继代培养的平均值，增殖率为一定培养时期内，外植体上分化的总芽数与接种外植体总数的比值。
实施例2 防止玻璃化保持MS基本培养基其它元素的含量不变(Ca2+加倍)，1/2倍大量元素(CaCl2与Ca(NO3)2的摩尔比为1∶1)，蔗糖40g/L，琼脂6g/L，PH5.8，各品种的激素浓度采用实施例1中的浓度。
用早春即将萌动的休眠芽为外植体，消毒灭菌后剥去芽鳞，切掉芽内小叶片，将剩余部分接种在培养基上培养。培养5周后进行继代，方法是自组培苗叶柄基部切去叶片，再沿茎的中轴纵切，在有新芽发生的部位的下方0.5厘米处横切，将得到的部分接种在新的培养基上培养(以后的继代过程相同)，共进行2次继代培养。观察记录实验结果。培养条件为室温25℃，光照时数14h/d，光强1800Lx。
表2培养基对‘乌龙捧盛’和‘明星’玻璃化苗比率影响的显著性比较
*表中所列的玻璃化苗比率为2次继代过程的平均值。
实施例3 防止褐化，各品种的激素浓度采用实施例1的浓度，蔗糖40g/L，琼脂6g/L，PH5.8。
‘乌龙捧盛’改良MS培养基、1/2微量元素、Ca2+加倍，CaCl2与Ca(NO3)2的摩尔比为1∶1。
‘明星’改良MS培养基、1/3微量元素、Ca2+加倍，CaCl2与Ca(NO3)2的摩尔比为1∶1。
以早春时期即将萌动的休眠芽为外植体，消毒灭菌后剥去芽鳞，切掉芽内小叶片，将剩余部分接种在培养基上培养，每7天观察记录各种品种在不同培养基上的褐化级别。培养5周后进行继代，方法是自组培苗叶柄基部切去叶片，再沿茎的中轴纵切，在有新芽发生的部位的下方0.5厘米处横切，将得到的部分接种在新的培养基上培养(以后的继代过程相同)。共进行3次继代培养，观察统计方法同初代培养。
培养条件为室温25℃，光照时数14h/d，光强1600Lx。
结果(3次继代过程的平均值)‘乌龙捧盛’50％为1～2级，38％为4～5级；‘明星’78％为1～2级，8.7％在4级以上。
说明褐化级别的划分1级，不褐化或基本不褐化；2级褐化颜色很浅，褐化范围在外植体周围0.3厘米以内；3级褐化颜色浅，褐化范围在外植体周围0.4厘米以内；4级褐化颜色居中，褐化范围在外植体周围0.5厘米以内；5级褐化颜色深，褐化范围在外植体周围0.5厘米左右；6级褐化颜色最深，褐化范围在外植体周围0.5厘米以上。
权利要求
1.一种牡丹组培苗增殖、褐化和玻璃化防止方法，其特征在于培养基为基本培养基+BAP 0.5-1.0mg/L+GA30.2-1.0mg/L。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于用于增殖时所述的基本培养基为MS培养基、Ca2+加倍。
3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于用于防止褐化时所述的基本培养基为改良MS培养基。
4.如权利要求3所述的培养基，其特征在于所述的改良MS培养基为1/2～1/3微量元素、Ca2+加倍，CaCl2与Ca(NO3)2的摩尔比为1∶1。
5.如权利要求1所述的培养基，其特征在于用于防止玻璃化时所述的基本培养基为改良MS培养基。
6.如权利要求5所述的培养基，其特征在于所述的改良MS培养基为1/2大量元素、Ca2+加倍，CaCl2与Ca(NO3)2的摩尔比为1∶1。
全文摘要
本发明涉及一种牡丹组培苗增殖及褐化和玻璃化防止方法，用早春即将萌动的休眠芽为外植体，消毒灭菌后剥去芽鳞，切掉芽内小叶片，将剩余部分接种在不同培养基上培养，然后定期进行继代培养，实现组培苗大量增殖并防止了褐化和玻璃化发生。本发明得到了适合不同品种增殖的适宜培养基与最佳激素浓度配比，普遍提高了牡丹组培苗的增殖率、减轻了玻璃化和褐化。
文档编号A01H4/00GK1742564SQ20051008659
公开日2006年3月8日 申请日期2005年10月12日 优先权日2005年10月12日
发明者成仿云, 李萍 申请人:北京林业大学