一种巫山淫羊藿组培快繁方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种巫山淫羊藿组培快繁方法。
【背景技术】
[0002]巫山淫羊藿勝为小檗科淫羊藿属多年生宿根性草本药用植物，是我国传统补益类中药，也是中国应用最为广泛、最为悠久的中药之一。巫山淫羊藿富含异戊稀基取代的黄酮类化合物，具补肾阳，强筋骨，祛风湿等功效。用于肾阳虚衰，阳痿遗精，筋骨痿软，风湿痹痛，麻木拘挛，绝经期弦晕等疾病的治疗。近年来研究发现，淫羊藿还有抗衰老、提高免疫功能、抑制肿瘤等功效，有很大的开发潜力，受到了国内外学者的高度重视。
[0003]由于野生巫山淫羊藿自然繁殖率低，生长缓慢加之人们掠夺性采挖，致使野生资源日益减少，远远不能适应国内外市场的经济发展和临床医学的需要，人工栽培虽已开展并建立了规范化种植基地，但是生产上栽培种苗主要是通过分株繁殖和根茎繁殖等传统方式繁育，由于病毒逐代传统，导致品质下降、产量低下。此外，淫羊藿种子发育差、具有深休眠的特性，繁殖发芽率低，生长缓慢，严重制约了其有性繁殖的繁殖系数及繁育周期。因此，本发明以巫山淫羊藿嫩芽为外植体，通过不定芽诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程成功获得了巫山淫羊藿离体再植株，建立巫山淫羊藿组织培养快速繁殖技术体系，可以在较短的时间内获得大量的种苗，对于保护巫山淫羊藿野生资源、保证药源，实现其可持续利用都有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供出一种巫山淫羊藿组培快繁方法，本发明以巫山淫羊藿嫩芽为外植体，通过不定芽诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程成功获得了巫山淫羊藿离体再植株，建立巫山淫羊藿组织培养快速繁殖技术体系，从而实现了本发明的目的。
[0005]本发明的一种巫山淫羊藿组培快繁方法，包括以下的步骤:
(I)外植体消毒:采取生长健康的巫山淫羊藿芽作为外植体，刮去芽痕，加洗洁精漂30min?50min,然后置于自来水下冲洗30?60min后移至超净工作台，用75%的酒精浸泡30?60s,再用0.l%HgCl2消毒4?1min,无菌水冲洗后剥除外层鳞片，再用0.l%HgCl 2浸泡2?5min，无菌水冲洗外植体至无泡沫为止，置于无菌的滤纸上吸干表面水分，剥取芽尖组织备用。
[0006](2)不定芽诱导:将已经灭菌芽剥去外层保护层，露出嫩绿的芽尖接种到诱导培养基进行不定芽诱导培养。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为1000?20001x，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%?80%的条件下培养15天后统计污染率，45天后统计诱导率。
[0007](3)增殖培养:将诱导所得到的长至2cm左右的丛生芽再分割成2?3个芽的芽丛接种到增殖培养基上进行继代培养。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为1000?20001X，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%?80%的条件下培养60天后统计增殖情况。
[0008](4)生根培养:将芽增殖培养基中I?4cm长的正常生长的新芽切下并接种至生根培养基中进行诱导生根。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为2000?30001x，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%?80%的条件下培养30天后统计生根情况。
[0009](5)炼苗移栽:挑选生长良好且根系较为发达的组培苗，进行炼苗。首先，将所选组培苗的瓶盖揭开，在组培室里炼苗I?3天，炼苗过程中，注意喷水保持湿度。然后将这些组培苗搬至炼苗室，炼苗2?5天。之后将小苗取出，洗净培养基，注意防止根系损伤，栽植到由园土:泥炭土:腐殖质=2:1:1混合成的基质中，移栽30天后统计成活率。
[0010]上述步骤(2 )所述的诱导培养基为:WPM+0.1?L Omg/LNAA+1.0?4.0mg/L6-BA+0.5 ?1.5mg/L GA3+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0011]上述步骤(3)所述的增殖培养基为:MS+1.0?2.0mg/L 6-BA+0.5?1.5mg/LNAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0012]上述步骤(4)所述的生根培养基为:l/2MS+0.1?1.0mg/LIBA+0.05?0.1%活性炭 +15 ?30g/L 鹿糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0013]本发明与现有技术相比的有益效果是:野生巫山淫羊藿自然繁殖率低，生长缓慢加之人们掠夺性采挖，致使野生资源日益减少，远远不能适应国内外市场的经济发展和临床医学的需要，人工栽培虽已开展并建立了规范化种植基地，但是生产上栽培种苗主要是通过分株繁殖和根茎繁殖等传统方式繁育，由于病毒逐代传统，导致品质下降、产量低下。此外，淫羊藿种子发育差、具有深休眠的特性，繁殖发芽率低，生长缓慢，严重制约了其有性繁殖的繁殖系数及繁育周期。因此，本发明以巫山淫羊藿嫩芽为外植体，通过不定芽诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程成功获得了巫山淫羊藿离体再植株，建立巫山淫羊藿组织培养快速繁殖技术体系，可以在较短的时间内获得大量的种苗，对于保护巫山淫羊藿野生资源、保证药源，实现其可持续利用都有十分重要的意义。
【具体实施方式】
[0014]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0015]实施例1
(I)外植体消毒:采取生长健康的巫山淫羊藿芽作为外植体，刮去芽痕，加洗洁精漂30min，然后置于自来水下冲洗30min后移至超净工作台，用75%的酒精浸泡30s，再用0.l%HgCl2消毒4min，无菌水冲洗后剥除外层鳞片，再用0.l%HgCl 2浸泡2min，无菌水冲洗外植体至无泡沫为止，置于无菌的滤纸上吸干表面水分，剥取芽尖组织备用。
[0016](2)不定芽诱导:将已经灭菌芽剥去外层保护层，露出嫩绿的芽尖接种到诱导培养基进行不定芽诱导培养。接种后置于每天光照13小时，光照强度为ΙΟΟΟΙχ，置于培养温度为25°C，空气相对湿度为75%的条件下培养15天后污染率低于5%，培养45天后诱导率为 85.5%。所述的诱导培养基为:WPM+0.6mg/LNAA+2.5mg/L 6-BA+l.0mg/L GA3+25g/L 蔗糖+4.7g/L 琼脂，pH 为 5.6。
[0017](4)增殖培养:将诱导所得到的长至2cm左右的丛生芽再分割成2?3个芽的芽丛接种到增殖培养基上进行继代培养。接种后置于每天光照13小时，光照强度为ΙΟΟΟΙχ，置于培养温度为25°C，空气相对湿度为75%的条件下培养60天后增殖系数为3.17。所述的增殖培养基为:MS+1.5mg/L 6-BA+0.8mg/LNAA+23g/L 蔗糖 +4.5g/L 琼脂，pH 为 5.5。