一种无患子组培快繁方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种无患子组培快繁方法。
【背景技术】
[0002]无患H Sspindus又名肥阜树，是无患子科的高大落叶乔木,是重要的天然肥皂来源。主要分布于淮河流域以南以及广东、福建、台湾、广西、云南等地，分布地域广阔。无患子树形高大，树干通直，树冠浓密，枝叶广展，叶形奇特，姿态优美。秋季满树叶色金黄，橙黄色的果实缀满枝头，观赏效果极好，是目前新兴的园林观叶、观果树种。在城市道路上种植无患子为绿化植物，也是一道很美的城市风景线，大规模栽培无患子树，能有效地绿化治理荒山，也是绿化造林的首选树种。无患子不仅是优良的园林色叶绿化树种，而且它的木材、嫩叶、果核、果肉、种仁等在医药、日化、工艺品、能源开发等方面都有较高的经济价值，是一种具有广阔开发利用前景的经济树种，已引起国内外专家的高度重视。但是，由于无患子的开发研究才刚刚开始，仍存很多问题亟待解决。
[0003]由于人为乱砍伐、自然破坏及物种退化等原因，目前野生无患子数量急剧减少，百年无患子古树极为稀有。无患子是落叶乔木，主要靠种子播种繁殖，其种皮骨质，坚硬，属硬实种子，在自然条件下，蛀虫率高，萌发率很低，而且出苗不整齐，出苗周期长，严重限制了无患子的自然更新和产业化应用。目前，人工种植的无患子大多使用天然种源的实生苗，而良种筛选、培育研究基础薄弱，导致良种选育相对滞后，良种优苗供应缺乏，难以保证连续性高产。
[0004]组织培养能够弥补种子繁殖的不足，减少对外界自然环境的依赖程度，不仅能保持母株优良特性不变，而且繁殖速度快，繁殖系数高，可降低生产成本，满足大规模种植无患子的需求。因此，本发明以无患子带节茎段为外植体，通过不定芽诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程成功获得了无患子离体再植株，建立无患子组织培养快速繁殖技术体系，为无患子的规模化育苗提供一条有效途径，为无患子苗木的工厂化生产及应用奠定基础。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供出一种无患子组培快繁方法，本发明以川百合鳞茎为外植体，通过不定芽诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程成功获得了川百合离体再植株，建立)I丨百合组织培养快速繁殖技术体系，从而实现了本发明的目的。
[0006]本发明的一种无患子组培快繁方法，包括以下的步骤:
(I)外植体消毒:在连续晴天3天以上、枝条无露水时进行取样，取样时间在上午9?10时。取无患子当年生枝条上的幼嫩带腋芽的茎段为外植体，清水洗去表面的污垢，在3%洗衣粉稀释液中浸泡30min以上，后在流动水下冲洗2h以上，转到超净工作台上，作灭菌处理。先用70%?80%乙醇溶液浸泡20s?60s，无菌水冲洗4?6次，再用0.1%?0.2%升汞溶液消毒5?15min，然后用无菌水冲洗外植体至无泡沫为止。最后将灭好菌的鳞片置于无菌的滤纸上吸干表面水分备用。
[0007](2)不定芽诱导:剪取步骤(I)长约2cm带腋芽的茎段并接种到诱导培养基进行不定芽诱导培养。接种后置于每天光照8?10小时，光照强度为1000?20001χ，置于培养温度为20?23°C，空气相对湿度为75%?80%的条件下培养15天后统计污染率，45天后统计诱导率。
[0008](3增殖培养:将诱导培养产生的不定芽从基部切割下来，剪成2cm左右的小段，接种到增殖培养基上进行继代培养。接种后置于每天光照10?14小时，光照强度为1000?20001x,置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%?80%的条件下培养30天后统计增殖情况。
[0009](4)生根培养:选取经增殖培养得到的2cm以上组培苗接种至生根培养基中进行诱导生根。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为2000?30001χ，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%?80%的条件下培养30天后统计生根情况。
[0010](5)炼苗移栽:选取长势良好、根系多又粗壮且株大于2 cm的组培苗进行炼苗。首先，将所选组培苗的瓶盖揭开，在组培室里炼苗I?3天，炼苗过程中，注意喷水保持湿度。然后将这些组培苗搬至炼苗室，炼苗2?5天。之后将小苗取出，洗净培养基，注意防止根系损伤。去掉部分叶片，较大的叶片剪去1/3。然后直接移栽或者在0.1%的多菌灵溶液中浸泡20 min后栽植到由河沙:泥炭土:腐殖质=2:1:1混合成的基质中，移栽30天后统计成活率。
[0011]上述步骤(2)所述的诱导培养基为:MS+0.01?0.lmg/LIBA+2.0?6.0mg/L6-BA+0.1 ?1.0mg/L NAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0012]上述步骤(3)所述的增殖培养基为:MS+1.0?2.0mg/L 6-BA+0.1?1.0mg/LIBA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0013]上述步骤(4)所述的生根培养基为:l/2MS+0.5?1.0mg/LIBA+0.1?1.0mg/LNAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0014]本发明与现有技术相比的有益效果是:通过组织培养能够弥补种子繁殖的不足，减少对外界自然环境的依赖程度，不仅能保持母株优良特性不变，而且繁殖速度快，繁殖系数高，可降低生产成本，满足大规模种植无患子的需求。以无患子带节茎段为外植体，通过不定芽诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程成功获得了无患子离体再植株，建立无患子组织培养快速繁殖技术体系，为无患子的规模化育苗提供一条有效途径，为无患子苗木的工厂化生产及应用奠定基础。
【具体实施方式】
[0015]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0016]实施例1
(I)外植体消毒:在连续晴天3天以上、枝条无露水时进行取样，取样时间在上午9?10时。取无患子当年生枝条上的幼嫩带腋芽的茎段为外植体，清水洗去表面的污垢，在3%洗衣粉稀释液中浸泡30min以上，后在流动水下冲洗2h以上，转到超净工作台上，作灭菌处理。先用70%乙醇溶液浸泡60s，无菌水冲洗5次，再用0.1%升汞溶液消毒8min，然后用无菌水冲洗外植体至无泡沫为止。最后将灭好菌的鳞片置于无菌的滤纸上吸干表面水分备用。
[0017](2)不定芽诱导:剪取步骤(I)长约2cm带腋芽的茎段并接种到诱导培养基进行不定芽诱导培养。接种后置于每天光照8小时，光照强度为ΙΟΟΟΙχ，置于培养温度为20°C，空气相对湿度为75%的条件下培养15天后污染率10.5%，培养45天诱导率为94.1%。所述的诱导培养基为:MS+0.05mg/LIBA+4.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+19g/L 蔗糖+4.5g/L 琼脂，pH为 5.5。
[0018](3增殖培养:将诱导培养产生的不定芽从基部切割下来，剪成2cm左右的小段，接种到增殖培养基上进行继代培养。接种后置于每天光照12小时，光照强度为ΙΟΟΟΙχ，置于培养温度为25°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后增殖系数为4.2，且没有愈伤组织形成，芽体最健壮，苗的长势较好。所述的增殖培养基为:MS+1.2mg/L 6-BA+0.6mg/LIBA+27g/L 蔗糖 +3.8