一种适用于大马士革玫瑰悬浮培养高效诱导不定芽的方法
【专利摘要】本发明公开了一种适用于大马士革玫瑰悬浮培养高效诱导不定芽的方法，采用了主要加入不同植物生长调节剂的1/2MS液体培养基进行不定芽诱导的技术特征，建立了大马士革玫瑰固体-液体-固体培养体系，愈伤组织诱导率为100%，不定芽分化率为90.9%，生根率为100%，移栽成活率为100%。本发明方法可以减轻大马士革玫瑰愈伤组织褐化程度，降低在培养过程中发生变异的几率，简单易行，解决了大马士革玫瑰组织培养过程中再生率比较低的问题，效率高，为大马士革玫瑰的组织培养和高频离体再生体系的建立提供了重要的技术基础。
【专利说明】一种适用于大马士革玫瑰悬浮培养高效诱导不定芽的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物组织培养【技术领域】，具体涉及一种通过悬浮培养提高大马士革不定芽分化的方法。
【背景技术】
[0002]大马士革玫瑰(Rosadamascena Mill.),蓄薇科(Rosales),蓄薇属(Rosaceae)，是提取玫瑰精油和玫瑰水的重要原料，主要应用在医疗保健、高档香水、美容用品、食品添加剂、烟草等行业。该品种玫瑰中含有300多种化学成分(如香茅醇、香叶醇等数百种芳香物质、有机酸等有益美容的物质)，还有人体需要的18种氨基酸及微量元素等，其中对人体有效成分高达120多种，比国内已有的玫瑰品种多了 80余种，是世界公认的优质玫瑰品种。但由于适应种植区域有限，其产量和价格满足不了日益增长的国际市场的需求，为了提高大马士革玫瑰的繁殖速度，缓解目前玫瑰传统繁殖方式不能满足市场需要的困境，采用新的方法提高大马士革玫瑰的再生率是大势所趋。
[0003]由于大马士革玫瑰具有显著的研究价值，目前研究重点主要在植物非试管快速繁殖和玫瑰精油提取等方面，大马士革组织培养技术却一直停滞不前，主要由于大马士革玫瑰分化难，愈伤组织易褐化，培养时间长等因素造成。这些不利因素使大马士革研究严重滞后，所以，通过悬浮培养促进不定芽的分化率，从而建立稳定的植物高频再生体系，对于大马士革玫瑰的深入研究具有积极作用。目前，大马士革玫瑰(Rosa damascene Mill.)组织培养已有少量报道，吴新海和薛志忠通过带叶芽茎段大马士革玫瑰(Rosa damascenaMill.)研究了在不同激素浓度下植株的继代增殖和生根培养(安徽农学通报，2010)，赵蓓蓓和刘松等通过带腋芽茎段获得了大马士革玫瑰的再生植株(园艺学报，2011)，而通过对疏松愈伤组织进行悬浮培养促进大马士革玫瑰不定芽分化的研究国内外未有报道。
【发明内容】
[0004]为了克服大马士革玫瑰再生率不高的问题，本发明采用悬浮培养进行诱导愈伤组织分化；本发明目的在于提供一种适用于大马士革玫瑰悬浮培养高效诱导不芽的方法，为大马士革规模化快繁和遗传操作研究奠定基础。该方法以大马士革玫瑰14天龄无菌叶片为外植体，建立固体诱导愈伤-液体诱导分化-固体促进生根的体系，同时调节诱导各阶段的光照强度，可以防止大马士革愈伤组织的褐化，降低在培养过程中发生变异的几率，并且极大的促进芽的分化。
[0005]为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案得以实现:
[0006]一种适用于大马士革玫瑰悬浮培养高效诱导不芽的方法，其特征在于，按以下步骤进行:
[0007](I)外植体的获得
[0008]取长出约14d的幼嫩叶片在自来水下冲洗干净，接着用75%酒精表面消毒30~40s,再在0.1%升萊溶液中灭菌 2~6min,用无菌水漂洗3~5次,最后在无菌条件下将叶片剪成四周有伤口、尺寸为IcmX Icm大小的叶片。
[0009]( 2)愈伤组织的诱导
[0010]将剪切好的叶片接种在诱导愈伤组织培养基上，在温度为25°C ±2°C、光照培养条件为500-2000LX的条件下培养，3周后将愈伤组织转到新鲜培养基上继代培养，每2周继代一次；所述的诱导愈伤组织培养基的组成为:在常规的MS培养基中加入30g.L-1的蔗糖，0.7% 的琼脂，2mg.L-1 的谷氨酰胺，(3-5) mg.L-1 的 2，4_D，(0.l-l)mg.L-1 的 6-BA，IOmg.L-1 的 AgNO3, pH 调为 5.8-6.2。
[0011](3)单细胞分散[0012]称取Ig新鲜疏松的愈伤组织，加入浓度为0.1%的果胶酶(溶于培养液或者
0.6mol/L的甘露醇溶液中，pH调至3.5)，黑暗中25°C中静置12_16h，再用电磁搅拌器低速搅动几分钟，即可获得细胞悬液，然后用血球计数板进行计数，参照所测得的单位愈伤组织的细胞数目，称取适量的愈伤组织，放入液体培养基的三角瓶中，在50rpm，25°C ±2°C连续振荡培养3周后，用100目的尼龙网过滤，可获得95%左右的单细胞。滤液用1500rpm的速度离心5min，离心后将2/3上清液倒掉，剩余的1/3摇匀，形成细胞悬液。
[0013](4)细胞悬浮培养诱导不定芽
[0014]离心后将2/3上清液倒掉，剩余的1/3摇匀，将细胞悬液倒入三角瓶中，根据需要的起始密度，补定量的新鲜液体1/2MS分化培养液，在150ml三角瓶含有40ml液体1/2MS分化培养液，摇床为50rpm，在温度为25°C ±2°C、光照强度为1000_2500Lx条件下，每天光照16h，进行诱导不定芽的形成；所述的液体1/2MS分化培养液的组成为:在1/2MS液体培养基中加入(1.5-3) mg.171 的 TDZ, (0.05-0.5)mg L-1 的 NAA, (0.1-1.0)mg L-1 的 6-BA，IOmg.I/1 的 AgNO3, (0.1-0.3) mg/L 的水解酪蛋白，pH 调至 5.8-6.2。
[0015]接种密度为IO5个/L，每Ild继代一次，筛选在液体分化培养基中继代2-3次的愈伤组织细胞系，将有绿色芽点细胞团从液体1/2MS分化培养基中取出，转入1/2MS固体分化培养基中继续培养，2-3周形成不定芽，所述的1/2MS固体分化培养基成分为:常规的1/2MS固体培养基中附加1.0mg.L-1的6-BA，0.5mg.L-1的ΝΑΑ，质量浓度为0.7%的琼脂，质量分数为3%的蔗糖，pH调至5.8-6.2。
[0016](5)苗的生根
[0017]待芽长至2-3cm，将诱导得到的芽剪下，插入诱导生根培养基中进行培养，所述的诱导生根培养基的组成为:在常规的1/4MS固体培养基中加入0.5mg.L—1的NAA，2%的蔗糖，0.8%的琼脂，0.1%~0.3%的活性炭；培养温度为250C ±2°C、光强为20001x、光照16h/天，培养2-3周后即可获得大量组培苗。
[0018]采用本发明的方法，大马士革不定芽分化率可高达90.9%。与传统固体培养相比，通过利用固-液-固的生长体系和调节光照强度，极大的抑制了愈伤组织的褐化，降低在培养过程中发生变异的几率，促进愈伤组织生长和提高不定芽分化率。
【具体实施方式】
[0019]以下结合发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0020]在以下实施例中，所述的MS培养基(或者1/2MS培养基或者1/4MS培养基)是目前使用最普遍的培养基，本领域的技术人员均可获得，其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。其主要成分为:
[0021 ]大量元素:NH4N03、KNO3> CaC12.2H20、MgSO4.7H20、KH2PO4 ；
[0022]微量元素:K1、H3BO3>MnSO4.4Η2。、ZnSO4.7Η20、Na2Mo04.2Η20、CuSO4.5Η20、CoCl2.6Η20 ；
[0023]铁盐=FeSO4.7Η2。；Na2-EDTA.2Η20 ；
[0024]有机成分:肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素(维生素BI)、甘氨酸。
[0025]实施例1:
[0026](1)外植体的获得
[0027]取长出14d左右的幼嫩叶片在自来水下冲洗干净，接着用75%酒精表面消毒30~40s,再在0.1%升萊溶液中灭菌2~6min,用无菌水漂洗3~5次,最后在无菌条件下将叶片剪成四周有伤口、约为IXlcm大小叶片。
[0028]( 2)愈伤组织的诱导
[0029]将剪切好的叶片接种在诱导愈伤组织培养基上，3周后将愈伤组织转到新鲜培养基上继代培养，每2周继代一次；所述的诱导愈伤组织培养基的组成为:在常规的MS培养基中加入30g *L_1的鹿糖,0.7%的琼脂，2mg *L_1的谷氨酰胺,3.0mg *L_1的2,4_D, 1.0mg *L_1的 6-BA, IOmg.1 的 AgNO3, pH 调为 5.8-6.2 ；
[0030]在温度为25°C ±2°C、光照培养条件为500-2000LX的条件下培养。叶片周围迅速膨胀，诱导出愈伤组织，诱导率可达100%，所诱导的愈伤组织绝大多数为质地疏松的淡黄色或淡绿色愈伤组织。
[0031](3)单细胞分散
[0032]称取Ig新鲜疏松的愈伤组织，加入0.1%果胶酶(溶于培养液或者0.6mol/L的甘露醇溶液中，PH调至3.5)，黑暗中25°C中静置12h~16h，再用电磁搅拌器低速搅动几分钟，即可获得细胞悬液，然后用血球计数板进行计数，参照所测得的单位愈伤组织的细胞数目，称取适量的愈伤组织，放入液体培养基的三角瓶中，在50rpm，25°C ±2°C连续振荡培养3周后，用100目的尼龙网过滤，可获得95%左右的单细胞。滤液用1500rpm的速度离心5min，离心后将2/3上清液倒掉，剩余的1/3摇匀，形成细胞悬液。
[0033](4)细胞悬浮培养诱导不定芽
[0034]离心后将2/3上清液倒掉，剩余的1/3摇匀，将细胞悬液倒入三角瓶中，，根据需要的起始密度，补定量的新鲜1/2MS分化培养液，150ml三角瓶含有40ml液体1/2MS分化培养液，摇床为50rpm，在温度为25°C ±2°C、光照强度为1000_2500Lx条件下，光照16h/天，进行诱导不定芽的形成；
[0035]所述的液体1/2MS分化培养液的组成为:在液体1/2MS培养基中加入2.0mg.1的 TDZ,0.5mg.L 1 的 NAA，1.0mg.L 1 的 6-BA, IOmg.L 1 的 AgNO3,0.3mg.L 1 的水解酪蛋白，PH 调至 5.8-6.2。
[0036]接种密度为IO5个/L，每Ild继代一次，筛选在液体分化培养基中继代2-3次的愈伤组织细胞系，将有绿色芽点细胞团从液体1/2MS分化培养基中取出，转入固体1/2MS分化培养基中继续培养，2-3周形成不定芽，该种1/2MS固体分化培养基成分为:常规的1/2MS培养基中附加1.0mg.I/1的6_BA，0.5mg.1的ΝΑΑ，0.7%的琼脂，3%的蔗糖，pH调至5.8-6.2。不定芽的诱导率可达90.9%。
[0037](5)苗的生根
[0038]待芽长至2-3cm，将诱导得到的芽剪下，插入诱导生根培养基中进行培养，所述的诱导生根培养基的组成为:在常规的1/4MS固体培养基中加入0.5mg.L—1的NAA，2%的蔗糖，0.8%的琼脂，0.1%~0.3%活性炭；培养温度为25°C ±2°C、光强为20001x、光照16h/天，生根率为100%，培养2-3周后即可获得大量组培苗。
[0039]实施例2:
[0040]( I)外植体的获得同实施例1中方法。
[0041](2)愈伤组织的诱导过程同实施例1，本实施例与实施例1所不同的是，所述的诱导愈伤组织培养基的组成为:在常规的MS培养基中加入30g.L-1的蔗糖，0.7%的琼脂，2mg.L-1 的谷氨酰胺，4.0mg.L-1 的 2,4-D, 0.5mg.L-1 的 6-BA, IOmg.L-1 的 AgNO3, pH 调为5.8 ~6.2 ;
[0042]在温度为25°C ±2°C、光照培养条件为500-2000LX的条件下培养。叶片周围膨大，诱导出愈伤组织，诱导率达100%，所诱导的愈伤组织绝大多数为质地不疏松的黄色或绿色愈伤组织。
[0043](3)单细胞分散方法同实施例1中所述方法。
[0044](4)细胞悬浮培养诱导不定芽过程同实施例1，本实施例与实施例所不同的是进行诱导不定芽的形成；所述的液体1/2MS分化培养液的组成为:在液体1/2MS培养基中加入
1.5mg.L 1 的 TDZ, 0.1mg.L 1 的 NAA，0.5mg.L 1 的 6-BA, IOmg.L 1 的 AgNO3,0.3mg.L 1 的水解酪蛋白，pH调至5.8-6.2。
[0045]接种密度为IO5个/L，每Ild继代一次，筛选继代2~3次的愈伤组织细胞系，将有绿色芽点细胞团从液体1/2MS分化培养基中取出，转入固体1/2MS分化培养基中进行壮苗生长，2-3周形成不定芽，不定芽分化率为79.5%，该种1/2MS固体分化培养基成分为:常规的1/2MS培养基中附加1.0mg.L-VBA，。.5mg.L^1NAA, 0.7%的琼脂，3%的蔗糖，PH调至5.8。
[0046](5)苗的生根过程同实施例1。
[0047]实施例3:
[0048]( I)外植体的获得同实施例1中方法。
[0049](2)愈伤组织的诱导过程同实施例1，本实施例与实施例1所不同的是，所述的诱导愈伤组织培养基的组成为:在常规的MS培养基中加入30g.L-1的蔗糖，0.7%的琼脂，2mg.L-1 的谷氨酰胺，5.0mg.L-1 的 2,4-D, 0.1mg.L-1 的 6-BA, IOmg.L-1 的 AgNO3, pH 调为
5.8-6.2 ；
[0050]在温度为25°C ±2°C、光照培养条件为500Lx~2000Lx的条件下培养。叶片周围膨大速度较慢，诱导出愈伤组织，诱导率达100%，所诱导的愈伤组织绝大多数为质地致密且较硬的绿色愈伤组织。
[0051](3)单细胞分散方法同实施例1中所述方法。
[0052](4)细胞悬浮培养诱导不定芽过程同实施例1，实施例与实施例1所不同的是进行诱导不定芽的形成；所述的液体1/2MS分化培养液的组成为:在液体1/2MS培养基中加入
3.0mg.L 1 的 TDZ, 0.05mg.L 1 的 NAA，0.5mg.L 1 的 6-BA, IOmg.L 1 的 AgNO3,0.1mg.L 1的水解酪蛋白，PH调至5.8-6.2。接种密度为IO5个/L，每Ild继代一次，筛选继代2_3次的愈伤组织细胞系，将有绿色芽点细胞团从液体1/2MS分化培养基中取出，转入固体1/2MS分化培养基中进行壮苗生长，2-3周形成不定芽，不定芽分化率为66.5%，所述1/2MS固体分化培养基成分为:常规的1/2MS培养基中附加1.0mg.L1的6-BA，0.5mg.L1的ΝΑΑ，0.7%的琼脂，3%的蔗糖，pH调至5.8。
[0053]( 5 )苗的生根 过程同实施例1。
【权利要求】
1.一种适用于大马士革玫瑰悬浮培养高效诱导不定芽的方法，其特征在于，按以下步骤进行: (1)外植体的获得 取长出14天的幼嫩叶片在自来水下冲洗干净，接着用浓度为75%的酒精表面消毒30s~40s,再在浓度为0.1%的升萊溶液中灭菌2min~6min,用无菌水漂洗3~5次,最后在无菌条件下将叶片剪成四周有伤口、且尺寸为IcmXlcm的叶片； (2)愈伤组织的诱导 将剪切好的叶片接种在诱导愈伤组织培养基上，在温度为25V ±2°C、光照培养条件为500Lx~2000Lx的条件下培养，3周后将愈伤组织转到新鲜的诱导愈伤组织培养基上继代培养，每2周继代一次； 所述的诱导愈伤组织培养基的组成为:以MS培养基为基础，加入30g -L-1的蔗糖，0.7%的琼脂，2mg *L_1 的谷氨酰胺，(3 ~5)mg *L_1 的 2,4-D, (0.1 ~l)mg *L_1 的 6-BA, IOmg *L_1的 AgNO3, pH 调为 5.8-6.2 ； (3)单细胞分散 称取Ig新鲜疏松的愈伤组织，加入浓度为0.1%的果胶酶，黑暗中25°C中静置12h~16h，再用电磁搅拌器低速搅动几分钟，即获得细胞悬液，然后用血球计数板进行计数，参照所测得的单位愈伤组织的细胞数目，称取适量的愈伤组织，放入液体培养基的三角瓶中，在50rpm,25°C ±2°C连续振荡培养3周后，用100目的尼龙网过滤，可获得95%的单细胞；滤液用1500rpm的速度离心5min，离心后将2/3上清液倒掉，剩余的1/3摇匀，形成细胞悬液； (4)细胞悬浮培养诱导不定芽 将细胞悬液倒入三角瓶中，根据需要的起始密度，补定量的新鲜的液体1/2MS分化培养液，三角瓶含有40ml的液体1/2MS分化培养液，摇床为50rpm，在温度为25°C ±2°C、光照强度为1000-2500LX条件下，每天光照16h，进行诱导不定芽的形成； 所述的液体1/2MS分化培养液的组成为:以液体1/2MS培养基为基础，加入(1.5-3)mg.L 1 的 TDZ, (0.05-0.5) mg.L 1 的 NAA, (0.1-1.0) mg.L 1 的 6-BA, 10mg.L -1 的 AgNO3,(0.1-0.3) mg.L-1 的水解酪蛋白，pH 调至 5.8-6.2 ； 接种密度为IO5个/L，每Ild继代一次，筛选在液体1/2MS分化培养基中继代2~3次的愈伤组织细胞系，将有绿色芽点细胞团从液体1/2MS分化培养基中取出，转入固体1/2MS分化培养基中继续培养，2-3周形成不定芽，该1/2MS固体分化培养基成分为:以1/2MS培养基为基础，附加1.0mg.1^-ΒΑ,0.5mg.L^1NAA, 0.7%的琼脂，质量分数为3%的蔗糖，pH调至 5.8-6.2 ； (5)苗的生根 待芽长至2-3cm，将诱导得到的芽剪下，插入诱导生根培养基中进行培养，所述的诱导生根培养基的组成为:以1/4MS培养基为基础，加入0.5mg -L-1的NAA，2%的蔗糖，0.8%的琼月旨，0.1%~0.3%的活性炭；培养温度为25°C ±2°C、光强为20001x、光照16h/天，培养2_3周后即获得大量组培苗。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的浓度为0.1%的果胶酶加入方法是溶于培养液或者0.6mol/L的甘露醇溶液中，pH调至3.5。
【文档编号】A01H4/00GK103651131SQ201310654295
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】黄萱, 冯欢, 易姝利, 刘梦昕, 曾洁, 姚静雯, 贾如, 左佳琪, 谢佳恒 申请人:西北大学