改良亚麻荠油的脂肪酸分布的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年1月23日提出的美国临时申请号61/589, 806的权益，并且 将其全文以引用方式并入。
技术领域
[0003] 本公开涉及分子生物学领域和植物中的脂肪酸合成的调控。更具体地，本公开提 供用于改良亚麻荠 （Camelina sativa)油中的脂肪酸组成的方法和组合物。
【背景技术】
[0004] 亚麻# (Camelina Sativa(L)Crtz.)是具有相对短的生长期、抗寒且耐旱的油料 种子作物，并且可使用相对较少肥料生长于边际土地上。由于能够生长于主要食用作物不 生长的区域和条件中，因此亚麻荠最近已在加拿大和美国被提出用于生物产业应用，例如 生物柴油、润滑剂和油脂化学原料。
[0005] 亚麻荠油是从种子中提取的并且通常包含25%到35%的单不饱和脂肪酸和50% 到60%的多不饱和脂肪酸（PUFA)。高PUFA含量赋予了在精制油中的低氧化稳定性，因此 限制了亚麻荠油在工业中的应用。除了其低氧化稳定性外，超过一个双键的存在也会导致 例如复分解和臭氧分解的过程中的不合需要的副产物。
【发明内容】
[0006] 本申请提供用于改良亚麻荠油中的脂肪酸的方法、构建体等。
[0007] 在一个方面，提供用于改良亚麻荠中的脂肪酸分布的方法，其包括相对于对照亚 麻荠植物阻抑FAD2和FAD3的表达。在一实施方案中，所述方法进一步包括阻抑FAEl的表 达。
[0008] 在另一方面，提供用于改良亚麻荠中的脂肪酸分布的方法，其包括相对于对照亚 麻荠植物阻抑FAD3的表达。
[0009] 在另一方面，提供用于改良亚麻荠中的脂肪酸分布的方法，其包括相对于对照亚 麻荠植物阻抑FAD2的表达。
[0010] 在另一方面，提供相对于对照亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD3的转基因亚麻荠 植物。在一个实施方案中，亚麻荠油是从所述植物中提取的。
[0011] 在另一方面，提供相对于对照亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD2的转基因亚麻荠 植物。
[0012] 另一方面提供相对于对照亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD2和FAD3的转基因亚麻 荠植物。在一个实施方案中，亚麻荠油是从所述植物的种子中提取的。
[0013] 另一方面提供相对于对照亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD2、FAD3和FAEl的转基 因亚麻荠植物。
[0014] 在另一方面，提供包含FAD3的分离的核酸分子。
[0015] 另一方面提供包含阻抑FAD3的核酸序列的构建体。在一个实施方案中，植物细胞 包含所述构建体。
[0016] 在另一方面，提供包含SEQ ID NO :80、83和86 (FAD2)中所述的amiRNA的构建体。
[0017] 在另一方面，提供包含SEQ ID NO :89、92和95 (FAD3)中所述的amiRNA的构建体。
[0018] 在另一方面，提供包含SEQ ID NO :98和101 (FAEl)中所述的amiRNA的构建体。
[0019] 在另一方面，提供用于产生高油酸亚麻荠油的方法，其包括（a)阻抑亚麻荠中的 FAD2、FAD3和FAE1，由此生成转基因亚麻荠植物，和（b)从所述转基因亚麻荠植物的种子中 提取油，其中所述油是高油酸的。
[0020] 在另一方面，提供用于降低亚麻荠油中的多不饱和脂肪酸的方法，其包括（a)阻 抑亚麻荠中的FAD2和FAD3,由此生成转基因亚麻荠植物，和（b)从所述转基因亚麻荠植物 产生的所述种子中提取油，其中所述油的多不饱和脂肪酸水平相对于来自非转基因植物的 油降低。
[0021] 在另一方面，提供高油酸亚麻荠油，其中所述油包含至少60%油酸（占总脂肪酸 的％ )。在一些实施方案中，高油酸亚麻荠油是指具有至少约50%到90%油酸的亚麻荠 油。例如，高油酸亚麻荠油可具有约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或 95%油酸。
[0022] 在另一方面，提供低亚麻酸（18 :3 Λ 9,12,15)亚麻荠油，其中所述油包含不超过 10%的亚麻酸（占总脂肪酸的％ )。
[0023] 在另一方面，提供用于降低亚麻荠中的亚麻酸（18 :3Δ 9,12,15)的方法，其包括 相对于对照亚麻荠植物阻抑FAD3。
[0024] 在另一方面，提供用于在亚麻荠中增加蓖麻油酸并降低12-羟基-顺式-9， 15-十八碳二稀酸（densipolic acid)的方法，其包括相对于表达油酸轻化酶的对照亚麻 荠植物阻抑FAD2和FAD3。在一些实施方案中，高蓖麻油酸油是指具有至少约15%到30% 蓖麻油酸的亚麻荠油。例如，高蓖麻油酸亚麻荠油可具有约15%、20%、25%或30%蓖麻油 酸。
[0025] 在另一方面，提供具有高油酸和巨头鲸鱼酸和降低的多不饱和脂肪酸的亚麻荠 油。在一个实施方案中，所述油是从阻抑FAD2和FAD3的植物中提取的。在一些实施方案 中，高巨头鲸鱼酸亚麻荠油是指具有至少约20-40%巨头鲸鱼酸的亚麻荠油。例如，高巨头 鲸鱼酸亚麻#油可具有约20%、25%、30%、35%或40%巨头鲸鱼酸。
[0026] 在另一方面，提供包含SEQ ID NO :80、83和86 (FAD2)中所述的amiRNA的转基因 植物。
[0027] 在另一方面，提供包含SEQ ID NO :89、92和95 (FAD3)中所述的amiRNA的转基因 植物。
[0028] 在另一方面，提供包含SEQ ID NO :98和101 (FAEl)中所述的amiRNA的转基因植 物。
[0029] 在另一方面，存在使用amiRNA改良亚麻荠油分布的方法。在一个实施方案中，所 述 amiRNA 陈述于 SEQ ID N0:80、83、86(FAD2) ;SEQ ID N0:89、92 和 95(FAD3);和 / 或 SEQ ID NO :98、101 (FAEl)中。
[0030] 在另一方面，本申请提供从相对于对照亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD2、FAD3和 FAEl的转基因亚麻荠植物中提取的油。
[0031] 在另一方面，申请人提供用于降低亚麻荠中的12-羟基-顺式-9,15-十八碳二烯 酸的方法，其包括相对于对照亚麻荠植物阻抑FAD3。
[0032] 在另一方面，提供用于改良亚麻荠中的脂肪酸分布的方法，其包括相对于对照亚 麻荠植物阻抑FAD2和FAEl的表达。在一个实施方案中，转基因亚麻荠相对于对照亚麻荠 植物具有受到阻抑的FAD2和FAEl的表达
[0033] 在另一方面，申请人提供用于改良亚麻荠中的脂肪酸分布的方法，其包括相对于 对照亚麻荠植物阻抑FAD3和FAEl的表达。在一个实施方案中，转基因亚麻荠相对于对照 亚麻荠植物具有受到阻抑的FAD3和FAEl的表达。
【附图说明】
[0034] 图1 :含有amiRNA表达盒和选择标记DsRed的T-DNA插入物的示意性图谱。 PsoyBcon :种子特异性大豆β伴大豆球蛋白启动子；Tphas :菜豆球蛋白（Phaseolin)终止 子序列；PCMV :组成型木薯叶脉花叶病毒启动子；Tnos :来自土壤杆菌胭脂碱合酶基因的终 止子序列；
[0035] 图2 :亚麻荠种子的靶标脂肪酸分布；
[0036] 图3 :高油酸亚麻荠 Τ2种子的脂肪酸分布；
[0037] 图4 :18 :3-沉默的亚麻荠 Τ2种子的脂肪酸分布；
[0038] 图5 :单个amiRNA表达盒的T-DNA插入物的示意性图谱。A)FAD2 amiRNA和选择 标记 DsRed ;B)FAD3 amiRNA 和 DsRed ;和 C) FAEl amiRNA 和 DsRed。PsoyBcon :种子特异性 大豆β伴大豆球蛋白启动子；Tphas :菜豆球蛋白终止子序列；PCMV :组成型木薯叶脉花叶 病毒启动子；Tnos :来自土壤杆菌胭脂碱合酶基因的终止子序列。
[0039] 图6 :串联amiRNA表达盒的T-DNA插入物的示意性图谱。Α)串联amiRNA表达盒 FAD2 amiRNA、FAD3 amiRNA和FAEl amiRNA，其侧接有种子特异性大豆β伴大豆球蛋白启动 子和菜豆球蛋白终止子序列Tphas的3'转录终止区；Β)串联amiRNA表达盒FAD2 amiRNA、 FAD3 amiRNA，且侧接有种子特异性大豆β伴大豆球蛋白启动子和菜豆球蛋白终止子序列 Tphas的3'转录终止区；FAEl amiRNA表达盒，其侧接来自大豆的Gy 1和来自豌豆豆球蛋 白 A2 基因的 3' 转录终止区（Rerie 等人（1991)Mol. Gen. Genet. 225 :148-157)。
【具体实施方式】
[0040] 本发明人认识到，虽然亚麻荠可经受住不合需要的生长条件，但常规亚麻荠油的 脂肪酸分布限制了其用途。亚麻荠油通常包含25%到35%的单不饱和脂肪酸和50%到 60%的多不饱和脂肪酸（PUFA)。高PUFA含量赋予了低氧化稳定性，因此限制了亚麻荠油在 工业中的应用。除了其低氧化稳定性外，超过一个双键的存在也会导致例如复分解和臭氧 分解的过程中的不合需要的副产物。因此，为了与其它工业原料竞争，本发明人预期改良亚 麻荠油的脂肪酸分布。
[0041] 因此且在一个方面，申请人预期增加单不饱和脂肪酸，例如油酸（18 :1，顺 式-9-十八碳烯酸）、巨头鲸鱼酸（20:1，顺式-11-二十碳烯酸）和芥酸（22:1，顺 式-13-二十二碳烯酸），而降低亚油酸（18 :2,顺式，顺式-9，12-十八碳二烯酸）及α亚 麻酸（18 :3,全顺式-9,12,15-十八碳三烯酸）。
[0042] 如此，申请人发现，例如，脂肪酸去饱和酶2(FAD2)、脂肪酸去饱和酶3(FAD3)和/ 或脂肪酸延长酶I