氢(H2O2)在BABA调节干旱胁迫的过程中起着信号分子的作用。
[0023]3.3对可溶性糖含量的影响
取约0.2g新鲜的烟草叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，置于1ml试管并加入5ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30分钟(提取两次)提取液过滤入25ml容量瓶中，反复冲洗试管及残澄，定容至刻度。取0.5ml提取液和1.5ml蒸饱水于20ml试管，依次加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管准确保温I分钟，取出冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测定吸光度值。计算结果如图5(a)所示，在干旱胁迫条件下，BABA使得烟草叶片中可溶性糖含量增加了 105%。说明BABA能诱导可溶性糖含量增加来提高烟草对干旱胁迫的抵御能力和烟叶的品质。
[0024]3.4对多酚含量的影响
取0.25g烟叶粉末于1ml 80%甲醇溶液，后置于37°C摇床震荡3h，将其在3500rpm下离心lOmin。提取液置于4°C保存。取0.05ml提取液和0.45ml蒸饱水于1ml试管中，后加入2.5ml 0.2N福林酚试剂，静置5-8分钟，加入2ml 75g/L Na2C03溶液，于30 °C下孵育1.5-2小时，期间不停摇晃。最后在765nm波长下测量其吸光度值。其计算结果如图5(b)所示，结果表明:在干旱胁迫条件下，经BABA处理和未经BABA处理的烟草叶片中多酚含量没有显著性差异，都相对于正常生长的烟草叶片含量都有提高，说明BABA不是通过改变烟草体内多酚含量来改变其对干旱胁迫的耐性。
[0025]3.5对可溶性蛋白含量的影响
取0.1g烟草叶片置于预冷的研钵并加入Iml pH=7.0 0.05mol/L磷酸缓冲液，充分研磨，12000rpm离心10分钟，转移提取液置于冰上待测试，取0.1ml提取液于1ml试管后加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，放置2分钟在595nm下测定其吸光度值，并通过标准曲线计算可溶性蛋白质含量。测定结果如图5(c)所示，干旱胁迫促使烟草叶片中可溶性蛋白有所降低，但经BABA处理的烟草叶片中可溶性蛋白含量显著增加，其比未经BABA处理的烟草叶片增加了 37.56%ο
[0026]3.6对脯氨酸含量的影响
取0.2g烟草叶片，置于试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液于沸水浴中浸提15分钟。取出试管，过滤，滤液待测。吸取2ml滤液，加入2ml冰乙酸和3ml酸性茚三酮，混匀后加封口薄膜，在沸水中加热30分钟，冷却。向管中加入5ml甲苯以萃取红色物质。避光静置20分钟以上。待分层后，吸取甲苯层，以先前设置空白管作为对照在520nm波长下比色。结果如图5(d)所示，结果表明:未经BABA处理烟草叶片中脯氨酸含量略有增加，相比对照增加了 32.15%，而BABA处理的烟草叶片中脯氨酸的含量大幅增加，相比对照增加了 440.88%。
[0027]3.7对抗氧化酶活性的影响
干旱胁迫通常会引起植物体产生氧化胁迫，但植物具有一套完整而复杂的抗氧化体系维持细胞内活性氧物质的动态平衡。超氧化物歧化酶(SOD)生命体内一种重要抗氧化酶，能有效的将植物体内的超氧阴离子(02_)转化成双氧水(H2O2)和氧气(O2);而植物体内的抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)具有将植物体内过氧化氢分解成对植物没有伤害作用的物质水和氧气。过氧化物酶(POD)同时还有清除细胞内有毒的酚类、胺类毒性物质的作用。故本发明分析了干旱胁迫下，BABA对这些酶活性的影响。具体实验步骤如下:
酶液提取:称取0.6g烟草叶片，置于预冷研钵中，加入3ml预冷的0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲液(含1%聚乙烯吡咯烷酮)和少量石英砂充分研磨，转移研磨液于2ml离心管，再加入3ml预冷的0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲液(含1%聚乙烯吡咯烷酮)冲洗研磨，4°C离心12000rpm，1min,转移提取液至5ml离心管，放于冰上备用。
[0028]超氧化物酶(SOD)活性测定:在1ml试管中加入1.5ml 0.05mol/L pH=7.8磷酸缓冲液、0.3ml 130mmol/L甲硫氨酸(Met)、0.3ml 750 ymol/L氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、0.3ml 100 ymol/L EDTA-Na2^0.5ml 蒸馏水、0.3ml 20 ymol/L 核黄素和 0.1ml 粗酶提取液。同时设两个不加酶液管，其中一个避光。将所有试管置于40001x日光灯下反应20min后，立即置于黑暗条件终止反应。以避光管作为空白参比调零，测定560nm下吸光度值。
[0029]过氧化氢酶活性(CAT)测定:CAT酶活性的测定根据南京建成工程研宄所试剂盒说明测定。
[0030]过氧化物酶(POD)活性测定:在1ml试管中加入反应液:2.9ml0.05mmol/L磷酸缓冲液、0.5ml 2%过氧化氢、0.1ml 2%愈创木酚、0.1ml酶液。以不加酶液的混合液调零，在470nm处测定OD值。以每分钟A47tl变化0.01为I个酶活性单位(U)。抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定:3ml混合液中含0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲液、0.lmmol/L EDTA-Na2,0.3mmol/L抗坏血酸(ASA)、0.06mmol/L过氧化氢和0.1ml酶液。加入过氧化氢后立即在20°C下测定10-30s内的A29tl变化，记录Os和120s的吸光值。以0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲液调零。
[0031]上述酶活性测定结果如下:如图6(a)所示，在干旱胁迫条件下，BABA能提高烟草体内超氧化物歧化酶(SOD)活性，进而减少超氧阴离子对烟草细胞的损害。抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化氢酶(CAT)活性结果分别如图6(b)和(c)所示，干旱胁迫增加了这两个酶的活性，但BABA处理后这两个酶活性受到了抑制，这将导致烟草体内过氧化氢含量的增加。如图6(d)所示，干旱胁迫下，烟草体内过氧化物酶活性在BABA处理后呈显著性增加，其虽能降解一部分过氧化氢，但同时也能清除干旱胁迫是产生的有毒酚类、胺类物质等。总的来说，还是增加了烟草体内过氧化氢的含量(如图4(b)所示)。由此我们可以推测出BABA通过抗氧化酶系统来清除烟草体内的超氧阴离子和其他一些有害氧化物质等而减少其对细胞的损害，同可以通过控制烟草体内信号分子过氧化氢的量来调节烟草对干旱胁迫的响应，最终到达提高烟草对干旱胁迫耐性的作用。
【主权项】
1.一种快速有效提高烟草抗旱能力的方法，其特征在于:用浓度0.2-10mmol/L的β -氨基丁酸水溶液对4-5叶期的植物植株灌根处理，连续灌根处理2?5天。
2.根据权利要求1所述的一种快速有效提高烟草抗旱能力的方法，其特征在于:用浓度5mmol/L的β -氨基丁酸水溶液对4_5叶期的烟草幼苗进行灌根处理，连续灌根处理3天，每株烟草幼苗的β -氨基丁酸水溶液用量为350?450ml ;提高烟草幼苗之后生长的抗旱能力。
【专利摘要】本发明公开了一种快速高效提高烟草抗旱能力的方法。具体方法是采用浓度0.2mmol/L-10mmol/L β-氨基丁酸(BABA)对4-5叶期的烟草幼苗进行灌根。通过β-氨基丁酸的预处理可以提高干旱胁迫条件下烟草的成活率及相对分含量和降低烟草体内的丙二醛含量和提高脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白的含量，同时还可以提高超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性，减少过氧化氢酶及抗坏血酸过氧化物酶活性和增加过氧化氢含量，故β-氨基丁酸通过调节抗氧化系统提高烟草抵御干旱胁迫的能力。β-氨基丁酸又是一种对环境无污染的绿色环保友好的物质且其应用操作简单并易于大规模推广，这将给烟草生产带来巨大的经济效益同时对发展绿色农业具有重大的意义。
【IPC分类】A01G7-06, A01P21-00, A01N37-44
【公开号】CN104663267
【申请号】CN201510121085
【发明人】陈学平, 何宽信, 顾厚武, 陈祝, 郭家明, 刘再强, 张清莉, 刘松, 单丹丹
【申请人】中国科学技术大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月19日