一种鹿角蕨组培快繁的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种鹿角蕨组培快繁的方法。
【背景技术】
[0002]蕨类植物起源于古生代志留纪和泥盆纪的裸蕨，全世界约有12000多种。其生活史中有两个能独立生活的植物体即孢子体和配子体，孢子体世代和配子体世代在蕨类植物生活史中交替出现，孢子体世代在蕨类植物的生活史中占有较大优势。蕨类植物对水、热条件极为敏感，且多数为阴生植物和附生植物，大部分类群需要森林植被为其提供生存的环境。中国由于森林生态系统类型多样，因而蕨类植物类群齐全，种类丰富。蕨类植物具有较高的药用价值，写信类黄酮、萜类、酚酸等多种结构类型的植物化学成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗HIV、抗氧化、抑菌、保肝、促进骨愈合等药理活性。此外，蕨类已成为观赏植物中的重要组成部分，在室内园艺、公园、庭院等环境的绿化、插花和工艺品制作等园林园艺事业中占据相当重要的地位，观赏蕨类的商品生产和栽培育种事业也相当发达，蕴藏着很大的开发潜力。
[0003]鹿角蕨为鹿角蕨科鹿角蕨属植物，为热带季雨林中的附生植物，其叶形别致，形似梅花鹿角，姿态高雅，别具热带情趣，是室内立体绿化的首选植物。由于鹿角蕨观赏期长和管理方便等优点，目前国际上将其作为盆栽观叶植物应用普遍，而我国才刚刚进入开发利用阶段，对鹿角蕨的研究处于起步阶段，实验室组培方面的研究也不够系统完善。研究表明，鹿角蕨从孢子播种开始，直至长出孢子体的时间大致为:孢子萌发需20天；由孢子长出原叶体需要50天以上；幼孢子体形成则需半年以上，而本发明建立鹿角蕨的离体再生体系，相对以孢子开始的途径大大缩短了生长周期，为鹿角蕨走向商品化生产开辟了途径，对观赏蕨类的组织培养具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供出一种鹿角蕨组培快繁的方法，本发明以鹿角蕨细嫩孢子叶为外植体,经过外植体消毒、GGB诱导、增殖、分化、生根等过程建立了鹿角蕨离体组培快繁方法，从而实现了本发明的目的。
[0005]本发明的一种鹿角蕨组培快繁的方法，包括以下的步骤:
1、一种鹿角蕨组培快繁的方法，其特征在于包括以下步骤:
(I)外植体消毒:选取健壮鹿角蕨的孢子叶新长出的嫩叶，用0.1%?0.3%高锰酸钾溶液浸泡10?30min，无菌水冲洗3?5次后用70%?80%乙醇浸泡10?20s，用无菌水清洗3?5次后用0.1%升汞溶液消毒I?5min，再用无菌水清洗3?5次后备用。
[0006](2)诱导培养:用解剖刀在经步骤(I)处理后孢子叶表面进行轻微划伤处理并正面朝上接种于诱导培养基中进行GGB诱导。接种后置于每天光照12?16小时，光照强度为1500?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成GGB。
[0007](3)增殖培养:将步骤(2)的获得的GGB接种到增殖培养基上进行增殖培养。接种后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养，每两周更换一次培养基。
[0008](4) GGB分化培养:将步骤(I)或(2)获得的GGB转接到分化培养基中进行GGB分化培养。接种后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养。接种后每两周更换一次培养基。
(5)生根培养:当经步骤(4)培养鹿角蕨孢子叶伸展，并由最初的长条状长出鹿角且长度约为1.5?2.5cm时转移至生根培养中进行诱导生根。
[0009]上述步骤(2)所述的诱导培养基为:MS+1.0?4.0mg/L6_BA+l.0?5.0mg/LNAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0010]上述步骤(3)所述的增殖培养基为:MS+1.0?3.0mg/LKT+0.1?lmg/LNAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0011]上述步骤(4)所述的分化培养基为:MS+0.5?1.5mg/L6-BA+0.1?0.5mg/LIBA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0012]上述步骤(5)所述的生根培养基为:MS+0.1?1.0mg/L ΝΑΑ+0.1?0.5mg/LIBA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0013]与现有技术相比本发明的优点是:通过植物组织培养技术在短时间内获得鹿角蕨试管苗的方法。以鹿角蕨细嫩孢子叶为外植体，经过外植体消毒、GGB诱导、增殖、分化、生根等过程建立了鹿角蕨离体组培快繁方法，以达到缩短生长周期，缓解鹿角蕨商业化生产种苗缺乏的现状，并为今后创新蕨类植物的种质资源奠定基础。
【具体实施方式】
[0014]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0015]实施例1:
(I)外植体消毒:选取健壮鹿角蕨的孢子叶新长出的嫩叶，用0.1%高锰酸钾溶液浸泡lOmin，无菌水冲洗4次后用75%乙醇浸泡10s，用无菌水清洗3次后用0.1%升汞溶液消毒3min,再用无菌水清洗5次后备用。
[0016](2)诱导培养:用解剖刀在经步骤(I)处理后孢子叶表面进行轻微划伤处理并正面朝上接种于诱导培养基中进行GGB诱导。接种后置于每天光照14小时，光照强度为15001x，培养温度为25°C的条件下培养20天后大部分外植体上长出棕褐色的根毛，接着根毛基部膨大长出嫩绿色GGB，待GGB长到一定大小时，幼嫩孢子叶开始白化或黄化，并被新长出的GGB覆盖。所述的诱导培养基为:MS+2.0mg/L6-BA+l.0mg/L NAA+3.5%蔗糖+0.5%琼脂，pH值为5.6。
[0017](3)增殖培养:将步骤(2)的获得的GGB接种到增殖培养基上进行增殖培养。接种后置于每天光照15小时，光照强度为25001x，培养温度为25°C的条件下培养30天后GGB明显增大，平均直径可达到0.8cm左右，每两周更换一次培养基。所述的增殖培养基为:MS+1.0mg/LKT+0.lmg/L NAA+3.5% 蔗糖 +0.35% 琼脂，pH 值为 5.6。
[0018](4) GGB分化培养:将步骤(I)或(2)获得的GGB转接到分化培养基中进行GGB分化培养。接种后置于每天光照14小时，光照强度为20001χ，培养温度为25°C的条件下培养30天即可分化出不定芽，分化率达93%。接种后每两周更换一次培养基。所述的分化培养基为:MS+0.5mg/L6-BA+0.lmg/L IBA+2.0% 蔗糖 +0.35% 琼脂，pH 值为 5.6。
[0019](5)生根培养:当经步骤(4)培养鹿角蕨孢子叶伸展，并由最初的长条状长出鹿角且长度约为1.5?2.5cm时转移至生根培养中进行诱导生根，培养20天后即可达到生根率96%以上。所述的生根培养基为:MS+0.lmg/L NAA+0.lmg/L IBA+3.5%蔗糖+0.35%琼脂，pH值为5.6。
[0020]实施例2:
(I)外植体消毒:选取健壮鹿角蕨的孢子叶新长出的嫩叶，用0.2%高锰酸钾溶液浸泡12min，无菌水冲洗5次后用78%乙醇浸泡11s，用无菌水清洗4次后用0.1%升汞溶液消毒5min,再用无菌水清洗5次后备用。
[0021](2)诱导培养:用解剖刀在经步骤(I)处理后孢子叶表面进行轻微划伤处理并正面朝上接种于诱导培养基中进行GGB诱导。接种后置于每天光照15小时，光照强度为20001x，培养温度为26°C的条件下培养23天后大部分外植体上长出棕褐色的根毛，接着根毛基部膨大长出嫩绿色GGB，待GGB长到一定大小时，幼嫩孢子叶开始白化或黄化，并被新长出的GGB覆盖。所述的诱导培养基为:MS+2.5mg/L6-BA+l.2mg/L NAA+3.8%蔗糖+0.4%琼脂，pH值为5.7。
[0022](3)增殖培养:将步骤(2)的获得的GGB接种到增殖培养基上进行增殖培养。接种后置于每天光照16小时，光照强度为25001x，培养温度为26°C的条件下培养30天后GGB明显增大，平均直径可达到0.8cm左右，每两周更换一次培养基。所述的增殖培养基为:MS+1.5mg/LKT+0.lmg/L NAA+3.5% 蔗糖 +0.4% 琼脂，pH 值为 5.7。
[0023](4) GGB分化培养:将步骤(I)或(2)获得的GGB转接到分化培养基中进行GGB分化培养。接种后置于每天光照15小时，光照强度为25001x，培养温度为26°C的条件下培养34天即可分化出不定芽，分化率达96%。接种后每两周更换一次培养基。所述的分化培养基为:MS+0.9mg/L6-BA+0.2mg/L IBA+2.5% 蔗糖 +0.35% 琼脂，pH 值为 5.7。
[0024](5)生根培养:当经步骤(4)培养鹿角蕨孢子叶伸展，并由最初的长条状长出鹿角且长度约为1.5?2.5cm时转移至生根培养中进行诱导生根，培养23天后即可达到生根率94%以上。所述的生根培养基为:MS+0.5mg/L NAA+0.12mg/L IBA+3.5%蔗糖+0.35%琼脂，pH值为5.6。
【主权项】
1.一种鹿角蕨组培快繁的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)外植体消毒:选取健壮鹿角蕨的孢子叶新长出的嫩叶，用0.1%?0.3%高锰酸钾溶液浸泡10?30min，无菌水冲洗3?5次后用70%?80%乙醇浸泡10?20s，用无菌水清洗3?5次后用0.1%升汞溶液消毒I?5min，再用无菌水清洗3?5次后备用； (2)诱导培养:用解剖刀在经步骤(I)处理后孢子叶表面进行轻微划伤处理并正面朝上接种于诱导培养基中进行GGB诱导，接种后置于每天光照12?16小时，光照强度为1500?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成GGB; (3)增殖培养:将步骤(2)的获得的GGB接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养，每两周更换一次培养基； (4)GGB分化培养:将步骤(I)或(2)获得的GGB转接到分化培养基中进行GGB分化培养，接种后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养，接种后每两周更换一次培养基； (5)生根培养:当经步骤(4)培养鹿角蕨孢子叶伸展，并由最初的长条状长出鹿角且长度约为1.5?2.5cm时转移至生根培养中进行诱导生根。
2.根据权利要求1所述的一种鹿角蕨组培快繁的方法，其特征在于步骤(2)所述的诱导培养基为:MS+1.0 ?4.0mg/L6-BA+l.0 ?5.0mg/L NAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5%琼脂，pH值为5.4?5.8。
3.根据权利要求1所述的一种鹿角蕨组培快繁的方法，其特征在于步骤(3)所述的增殖培养基为:MS+1.0 ?3.0mg/LKT+0.1 ?lmg/L NAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼月旨，pH值为5.4?5.8。
4.根据权利要求1所述的一种鹿角蕨组培快繁的方法，其特征在于步骤(4)所述的分化培养基为:MS+0.5 ?1.5mg/L6-BA+0.1 ?0.5mg/L IBA+2.0% ?3.5%蔗糖 +0.35% ?0.5%琼脂，pH值为5.4?5.8。
5.根据权利要求1所述的一种鹿角蕨组培快繁的方法，其特征在于步骤(5)所述的生根培养基为:MS+0.1 ?1.0mg/L ΝΑΑ+0.1 ?0.5mg/L IBA+2.0% ?3.5%蔗糖 +0.35% ?0.5%琼脂，pH值为5.4?5.8。
【专利摘要】本发明公开了一种鹿角蕨组培快繁的方法，涉及鹿角蕨（Platycerium wallichii）通过植物组织培养技术在短时间内获得鹿角蕨试管苗的方法。本发明以鹿角蕨细嫩孢子叶为外植体，经过外植体消毒、GGB诱导、增殖、分化、生根等过程建立了鹿角蕨离体组培快繁方法，以达到缩短生长周期，缓解鹿角蕨商业化生产种苗缺乏的现状，并为今后创新蕨类植物的种质资源奠定基础。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104663442
【申请号】CN201510087218
【发明人】杨惠才
【申请人】杨惠才
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月25日