一种荷叶铁线蕨离体再生体系的建立方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种荷叶铁线蕨离体再生体系的建立方法。
【背景技术】
[0002]蕨类植物也称羊齿植物，起源于古生代志留纪和泥盆纪的裸蕨，分类地位介于苔藓植物和种子植物之间。蕨类植物除少数具有假根外，均有根、茎、叶的分化，内有维管组织，是维管植物中的一群，在现今的分类系统上被认为是组成现代植物界的大门之一，是地球上古代和现代植物界中的一个重要组成部分。蕨类植物的生活史中有两个能独立生活的植物体，及孢子体和配子体，具有明显的世代交替现象。蕨类植物以孢子传播，因孢子很轻，可以传播很远的距离，因而在地理分布上蕨类植物比种子植物更广泛。在我国，蕨类植物拥有悠久的民间药食兼用传统，其不仅营养成分齐全、含量丰富、鲜美可口，而且具有舒筋活血、除湿镇痛、宁神安眠、清热解毒、止咳化痰、止血驱虫和止痢抑菌等功效。多数蕨类植物具有较高的观赏价值，有“无花之美”之称，日本、欧美等国更是把蕨类植物视为高贵素雅的象征。
[0003]荷叶铁线蕨(reniforme rar.系铁线蕨科铁线蕨属植物，为中国特有种，国家二级保护植物。荷叶铁线蕨为多年生同型孢子蕨，叶形似荷叶，具有较高的药用价值而闻名。由于人为过度挖掘以及生境被破坏等原因，使得荷叶铁线蕨瀕临灭绝。近年来随着人们对荷叶铁线蕨的保护和研究，其株型小巧，别致优美的观赏特性也受到人们的关注而倍受青睐。目前在国内关于蕨类植物再生体系的研究鲜有报道，因此，建立荷叶铁线蕨的离体再生体系，对保护瀕危植物和进行商品化生产具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供出一种荷叶铁线蕨离体再生体系的建立方法，本发明以荷叶铁线蕨的成熟孢子为外植体，经过外植体消毒、孢子萌发培养、增殖与分化等步骤建立了荷叶铁线蕨离体再生体系，从而实现了本发明的目的。
[0005]本发明的一种荷叶铁线蕨离体再生体系的建立方法，包括以下的步骤:
(I)外植体采取及处理:选择孢子囊群盖变为褐色、孢子囊群没有开裂的孢子叶剪下，置于干燥纸袋中，自然晾干。5?7天后孢子囊自然开裂，孢子散落于纸袋中，清除袋内杂质，收集干燥的孢子置于离心管中，并将装有孢子的离心管置于冰箱2?4°C保存备用。
[0006](2)孢子的消毒:选取经步骤(I)处理后的孢子置于1.5mL离心管中，在离心管中加入I?2滴吐温和适量蒸溜水，盖上离心管盖，稍稍摇晃后平放静置3?8min，然后将孢子在混合液中震荡均匀后转移到快速滤纸上，通过漏斗将过滤的废水用锥形瓶接住并迅速将该过滤装置置于超净工作台中，先用无菌水冲洗3?5次后用70%?80%乙醇浸泡10?40s,用无菌水清洗3?5次后用0.1%升萊溶液消毒I?1min,再用无菌水清洗3?5次后备用。
[0007](3)孢子萌发培养:将经步骤(2)处理后孢子配置成浓度为0.3?1.0mg/mL的孢子悬浊液接种于萌发培养基上进行孢子萌发培养。接种后置于每天光照12?15小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至孢子萌发。
[0008](4)增殖培养:将步骤(3)的孢子萌发开始，生长80?100天后的原叶体切割成5_X5mm大小并接种到增殖培养基上进行原叶体的增殖培养。接种后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养，约60天继代一次。
[0009](5)GGB的诱导:将步骤(4)增殖的带有走茎的细嫩孢子体接种到诱导培养基上进行GGB诱导培养。接种后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养，接种后每两周更换一次培养基。
[0010](6)GGB分化培养:将步骤(5)诱导得到的GGB转接到分化培养基中进行GGB分化培养。接种后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养。接种后每两周更换一次培养基。
上述步骤(3)所述的萌发培养基为:MS+0.5?1.0mg/L6-BA+l?3mg/L 2，4-D+2.0%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%琼脂，pH值为5.4?5.8。
[0011]上述步骤(4)所述的增殖培养基为:MS+0.1?0.5mg/L6-BA+0.5?lmg/L2，4-D+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0012]上述步骤(5)所述的GGB诱导培养基为:MS+0.01?0.5mg/L6_BA+l?3mg/LNAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0013]上述步骤(6)所述的GGB分化培养基为:MS+0.1?L Omg/L ZT+2.0%?3.5%蔗糖+0.35% ?0.5% 琼脂，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0014]与现有技术相比本发明的优点是:通过植物组织培养技术以GGB途径再生的方法。以荷叶铁线蕨的成熟孢子为外植体，经过外植体消毒、孢子萌发培养、增殖与分化等步骤建立了荷叶铁线蕨离体再生体系，对瀕危植物保护和缓解商业化生产需求具有重要意义。
【具体实施方式】
[0015]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0016]实施例1:
(I)外植体采取及处理:选择孢子囊群盖变为褐色、孢子囊群没有开裂的孢子叶剪下，置于干燥纸袋中，自然晾干。5天后孢子囊自然开裂，孢子散落于纸袋中，清除袋内杂质，收集干燥的孢子置于离心管中，并将装有孢子的离心管置于冰箱2°C保存备用。
[0017](2)孢子的消毒:选取经步骤(I)处理后的孢子置于1.5mL离心管中，在离心管中加入I滴吐温和适量蒸溜水，盖上离心管盖，稍稍摇晃后平放静置4min，然后将孢子在混合液中震荡均匀后转移到快速滤纸上，通过漏斗将过滤的废水用锥形瓶接住并迅速将该过滤装置置于超净工作台中，先用无菌水冲洗3次后用75%乙醇浸泡10s，用无菌水清洗3次后用0.1%升汞溶液消毒5min，再用无菌水清洗4次后备用。
[0018](3)孢子萌发培养:将经步骤(2)处理后孢子配置成浓度为0.4mg/mL的孢子悬浊液接种于萌发培养基上进行孢子萌发培养。接种后置于每天光照13小时，光照强度为20001x，培养温度为26°C的条件下培养14天后孢子萌发。所述的萌发培养基为:MS+0.6mg/L6-BA+1.2mg/L 2，4-D+3.5% 蔗糖 +0.5% 琼脂，pH 值为 5.6。
[0019](4)增殖培养:将步骤(3)的孢子萌发开始，生长90天后的原叶体切割成5mmX5mm大小并接种到增殖培养基上进行原叶体的增殖培养。接种后置于每天光照13小时，光照强度为20001x，培养温度为26°C的条件下培养60天后原叶体从形态上有明显变化，原叶体数量增多，且聚集成簇状形成较大的原叶体团，鲜重明显增加。所述的增殖培养基为:MS+0.2mg/L6-BA+0.6mg/L 2，4-D+2.0% 蔗糖 +0.35% 琼脂，pH 值为 5.6。
[0020](5) GGB的诱导:将步骤(4)增殖的带有走茎的细嫩孢子体接种到诱导培养基上进行GGB诱导培养。接种后置于每天光照13小时，光照强度为20001χ，培养温度为26°C的条件下培养，接种后每两周更换一次培养基，培养60天后孢子体的末端，及走茎上产生了嫩绿的GGB，大小约0.5cm,诱导