一种桂花幼胚培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物技术中离体快繁的育种方法，具体地说，涉及一种桂花幼胚培养方法。
【背景技术】
[0002]桂n Osmamthus fragrans )是我国十大传统名花之一,其花期正值我国传统佳节中秋节，开花时香闻数里，有“独占三秋压群芳”之誉，在庭院绿化和香料生产中具有重要的地位和影响。桂花在我国的栽培历史悠久，在南岭以北至秦岭淮河流域以南的广大地区均有栽培，并形成了苏州、咸宁、成都、杭州和桂林等历史上著名的“五大桂花产区”。2004年从我国取得“国
际桂花登录权威”以后，我国桂花的生产、开发、推广应用正呈现出日新月异的面貌，桂花产业有了长足发展，面积快速增长，品种日益丰富，市场销售持续火爆。
[0003]桂花可以采用播种、嫁接、扦插、压条等方法繁殖。然而这些方式也存在一定的局限性。播种繁殖的种子需经过生理后熟期，繁殖所用时间较长。扦插、压条等方式耗费人力物力大、繁殖效率较低而且容易受到气候的影响，这些因素极大限制了桂花的应用和进一步开发。自然条件下，桂花果实成熟后种子一般要第二年才能萌发，木质化种壳对水分的阻碍以及胚乳的包裹作用可能是导致桂花种子休眠的原因。一般来说，种子休眠与萌发不仅与植物内源激素的绝对含量有关，还与各类激素之间的平衡有关。处于休眠的种子大多数可通过直接或间接调节激素水平来实现人工控制。目前关于桂花幼胚培养的研究报道较少，而且还存在一些不一致的观点，还没有形成较成熟完善的理论体系。因此，很有必要建立桂花幼胚培养技术体系，为构建桂花再生体系积累经验。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供出一种桂花幼胚培养方法，本发明以“籽丹”桂未成熟果实为外植体，经过外植体消毒、幼胚培养、生根培养、炼苗移栽等步骤建立了桂花离体幼胚的培养技术体系，从而实现了本发明的目的。
[0005]本发明的一种桂花幼胚培养方法，包括以下的步骤:
(I)外植体消毒处理:选取桂花饱满健康的未成熟果实，采摘后先在2?4°C条件下进行低温预处理I?5天后用洗洁精水溶液浸泡5?1min,然后用自来水冲洗10?30min。剥去果皮、果肉，将获得的种子先用吐温清水洗I次后用自来水冲洗5?7次，擦干表面水分后在超净工作台中以70%?80%乙醇浸泡5?10s，0.1%升汞溶液消毒8?20min，再用无菌水清洗3?5次后用无菌滤纸擦干后备用。
[0006](2)幼胚培养:将步骤(I)处理后种子置于无菌滤纸上用已消毒的镊子和解剖刀剖开种皮取出幼胚接种于幼胚培养基上进行幼胚培养，接种后置于每天光照12?15小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至幼胚萌发。
[0007](3)生根培养:将步骤(2)所获得的长出2?3对真叶的幼苗在根颈以下0.6?1.2cm处剪断主根后接种到生根培养基上进行促根培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养I?3天，然后置于每天光照10?12小时，光照强度为2000?25001x，培养温度为25?28 °C的条件下培养至生根。
[0008](4)炼苗移栽:待幼苗长至6?9cm高后置于自然光照下炼苗5?7天后，洗净根部培养基，移栽至草炭土基质中，一周之内避免阳光照射，并向基质和叶片施用1/4MS大量元素营养液，保持湿度。7天后逐渐撤去遮荫物，并逐步减少营养液施用次数，待幼苗成活后再移栽大田。
[0009]上述步骤(2)所述的幼胚培养基为:Β5+0.5?1.5mg/L6-BA+l?5mg/L GA+2.0%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%琼脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值为5.4?5.8。
[0010]上述步骤(3)所述的生根培养基为:B5+1?4mg/L NAA+2.0%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%琼脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值为5.4?5.8。
[0011]与现有技术相比本发明的优点是:通过植物细胞培养技术培养离体胚，以破除桂花种子休眠，实现较高的种子萌发率。本发明以“籽丹”桂未成熟果实为外植体，经过外植体消毒、幼胚培养、生根培养、炼苗移栽等步骤建立了桂花离体幼胚的培养技术体系，以期为建立桂花再生体系、利用基因工程和细胞工程改良桂花品种奠定基础。
【具体实施方式】
[0012]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0013]实施例1:
(I)外植体消毒处理:选取桂花饱满健康的未成熟果实，采摘后先在2°c条件下进行低温预处理3天后用洗洁精水溶液浸泡5min，然后用自来水冲洗25min。剥去果皮、果肉,将获得的种子先用吐温清水洗I次后用自来水冲洗5次，擦干表面水分后在超净工作台中以75%乙醇浸泡8s，0.1%升汞溶液消毒lOmin，再用无菌水清洗5次后用无菌滤纸擦干后备用。
[0014](2)幼胚培养:将步骤(I)处理后种子置于无菌滤纸上用已消毒的镊子和解剖刀剖开种皮取出幼胚接种于幼胚培养基上进行幼胚培养。接种后置于每天光照13小时，光照强度为20001χ，培养温度为28°C的条件下培养3天后幼胚两片子叶开始分开，5天后幼胚体积明显增大，7天后就有约一半的桂花幼胚从胚轴开始转绿，有的子叶也开始变绿，15天后，绝大多数成活幼胚的胚轴和子叶都变绿，此后，子叶伸展长大，并开始抽出真叶。所述的幼胚培养基为:B5+L 2mg/L6-BA+3mg/L GA+3.5%蔗糖+(λ 35%琼脂+(λ 05%活性炭，pH值为 5.8。
[0015](3)生根培养:将步骤(2)所获得的长出2?3对真叶的幼苗在根颈以下0.6?1.2cm处剪断主根后接种到生根培养基上进行促根培养，接种后先在28°C条件下全暗培养2天，然后置于每天光照11小时，光照强度为25001x，培养温度为28°C的条件下培养31天后，生根率达94.7%,生根幼苗平均生根数量为4.8条。所述的生根培养基为:B5+2mg/LNAA+2.0%蔗糖+0.35%琼脂+0.05%活性炭，pH值为5.8。
[0016](4)炼苗移栽:待幼苗长至6?9cm高后置于自然光照下炼苗5天后，洗净根部培养基，移栽至草炭土基质中，一周之内避免阳光照射，并向基质和叶片施用1/4MS大量元素营养液，保持湿度。7天后逐渐撤去遮荫物，并逐步减少营养液施用次数，待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率为92%。
[0017]实施例2:
(I)外植体消毒处理:选取桂花饱满健康的未成熟果实，采摘后先在4°C条件下进行低温预处理5天后用洗洁精水溶液浸泡8min，然后用自来水冲洗20min。剥去果皮、果肉,将获得的种子先用吐温清水洗I次后用自来水冲洗5次，擦干表面水分后在超净工作台中以75%乙醇浸泡6s，0.1%升汞溶液消毒12min，再用无菌水清洗5次后用无菌滤纸擦干后备用。
[0018](2)幼胚培养:将步骤(I)处理后种子置于无菌滤纸上用已消毒的镊子和解剖刀剖开种皮取出幼胚接种于幼胚培养基上进行幼胚培养。接种后置于每天光照12小时，光照强度为25001x，培养温度为28°C的条件下培养4天后幼胚两片子叶开始分开，57天后幼胚体积明显增大，9天后就有约一半的桂花幼胚从胚轴开始转绿，有的子叶也开始变绿，18天后，绝大多数成活幼胚的胚轴和子叶都变绿，此后，子叶伸展长大，并开始抽出真叶。所述的幼胚培养基为:B5+1.5mg/L6-BA+3.5mg/L GA+3.0% 蔗糖 +0.35% 琼脂 +0.07% 活性炭，pH 值为 5.6。
[0019](3)生根培养:将步骤(2)所获得的长出2?3对真叶的幼苗在根颈以下0.6?1.2cm处剪断主根后接种到生根培养基上进行促根培养，接种后先在28°C条件下全暗培养3天，然后置于每天光照11小时，光照强度为25001x，培养温度为28°C的条件下培养30天后，生根率达94%，生根幼苗平均生根数量为5.3条。所述的生根培养基为:B5+3.5mg/LNAA+2.0%蔗糖+0.35%琼脂+0.07%活性炭，pH值为5.6。
[0020](4)炼苗移栽:待幼苗长至6?9cm高后置于自然光照下炼苗5天后，洗净根部培养基，移栽至草炭土基质中，一周之内避免阳光照射，并向基质和叶片施用1/4MS大量元素营养液，保持湿度。7天后逐渐撤去遮荫物，并逐步减少营养液施用次数，待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率为91%。
【主权项】
1.一种桂花幼胚培养方法，其特征在于包括以下步骤: (1)外植体消毒处理:选取桂花饱满健康的未成熟果实，采摘后先在2?4°C条件下进行低温预处理I?5天后用洗洁精水溶液浸泡5?1min,然后用自来水冲洗10?30min,剥去果皮、果肉，将获得的种子先用吐温清水洗I次后用自来水冲洗5?7次，擦干表面水分后在超净工作台中以70%?80%乙醇浸泡5?10s，0.1%升汞溶液消毒8?20min，再用无菌水清洗3?5次后用无菌滤纸擦干后备用； (2)幼胚培养:将步骤(I)处理后种子置于无菌滤纸上用已消毒的镊子和解剖刀剖开种皮取出幼胚接种于幼胚培养基上进行幼胚培养，接种后置于每天光照12?15小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至幼胚萌发； (3)生根培养:将步骤(2)所获得的长出2?3对真叶的幼苗在根颈以下0.6?1.2cm处剪断主根后接种到生根培养基上进行促根培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养I?3天，然后置于每天光照10?12小时，光照强度为2000?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养至生根； (4)炼苗移栽:待幼苗长至6?9cm高后置于自然光照下炼苗5?7天后，洗净根部培养基，移栽至草炭土基质中，一周之内避免阳光照射，并向基质和叶片施用1/4MS大量元素营养液，保持湿度，7天后逐渐撤去遮荫物，并逐步减少营养液施用次数，待幼苗成活后再移栽大田。
2.根据权利要求1所述的一种桂花幼胚培养方法，其特征在于步骤(2)所述的幼胚培养基为:B5+0.5 ?1.5mg/L6-BA+l ?5mg/L GA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值为5.4?5.8。
3.根据权利要求1所述的一种桂花幼胚培养方法，其特征在于步骤(3)所述的生根培养基为:B5+1 ?4mg/L NAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH值为5.4?5.8。
【专利摘要】一种桂花幼胚培养方法，涉及桂花（Osmamthus fragrans）通过植物细胞培养技术培养离体胚，以破除桂花种子休眠，实现较高的种子萌发率。本发明以“籽丹”桂未成熟果实为外植体，经过外植体消毒、幼胚培养、生根培养、炼苗移栽等步骤建立了桂花离体幼胚的培养技术体系，以期为建立桂花再生体系、利用基因工程和细胞工程改良桂花品种奠定基础。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104663444
【申请号】CN201510087221
【发明人】杨惠才
【申请人】杨惠才
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月25日