大规模生产包含共生体的人工种子的方法

大规模生产包含共生体的人工种子的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于选择和培育生物，特别是在植物中表现出与共生生物（如内生真 菌或附生植物或细菌微生物组（microbiome))具有共生行为的生物的新方法，以及由此产 生的新的生物和共生体。
【背景技术】
[0002] 多种家畜、作物和牧草的表型取决于该个体的基因型和共生生物的基因型之间的 相互作用。通常发现重要的植物（包括饲草、豆科植物、树木、灌木和藤本植物）与内生菌 (包括真菌、细菌、病毒和微生物）存在关联。类似地，重要的动物（包括牛、绵羊、猪、山羊 等）在其肠道和瘤胃中存在这样的内生菌。
[0003] 这类联合体（association)同时引起有益和有害的园艺学、农艺学和兽医特性， 包括对水胁迫和营养胁迫的改善的耐受性以及对虫害的抗性。
[0004] 例如，如果正确基因型的内生真菌寄居在黑麦草植物中，则该植物可表现出改善 的干旱耐受性和持久性。类似地，在禾本科植物中，由内生菌产生的特定代谢物（特别是黑 麦草碱和波胺（peramine))可提供抗虫性。由内生真菌产生的其他代谢物，例如黑麦草震 颤素（Iolitrem)和麦角生物碱类，可对食草动物有毒并可降低食草动物摄食。
[0005] 已知在共生生物如内生菌的代谢物谱中存在大量变化。例如，已将缺少所述动物 毒素之一或两者的内生真菌菌株引入到商业黑麦草品种中。
[0006] 在动物中，存在于肠道中的微生物负责消化动物饲料。瘤胃微生物-牛共生体可 在例如改善饲料转化效率和降低甲烷生产上是重要的。在反刍动物中，对劣质饲料的成功 消化可依赖于具有特定瘤胃微生物组谱。
[0007] 已经将分子遗传标记物（如简单序列重复（SSR)标记物）开发为区分共生生物分 类群和检测分类群内遗传变异的诊断测试。可将所述标记物用于区分具有不同毒素谱的共 生生物菌株。
[0008] 但是，仍然需要鉴定、分离和/或表征表现出与共生生物（如内生菌）具有共生行 为的生物的方法。人工培育这些共生体中的困难限制其实用性。例如，许多已知对牧草农 业有利的新型内生菌表现出低接种频率并且在优良种质中的稳定性较差。
[0009] 另外，在传统育种技术中，例如在饲草（如多年生黑麦草和高羊茅）中，使用传统 杂交育种技术培育禾本科植物品种，并且在多年时间内监测它们的性能之后，选择禾本科 植物基因型的优越特性。然后用单一内生菌接种构成所述实验品种的所选择的禾本科植物 基因型，并且评估所产生的禾本科植物-内生菌联合体（association)的任何有利特性例 如抗虫性。随后评估每一个在其中采用单一内生菌的实验性合成品种的农艺学性能以及通 过在数年时间内牧养动物评估所产生的动物性能。该评估方法可揭示：在不同的实验性合 成品种中使用的单一内生菌可能在一些所述品种中不具有营养稳定性和/或代间稳定性， 或者由所述单一内生菌赋予的所需生物碱谱可在不同的合成品种中变化，无法赋予适当水 平的抗虫性或引起动物中毒。如果该耗时的方法可被加速或改进，这会是本领域中的一个 重大的发展。
[0010] 因此，本发明的目的是克服、或至少缓解与现有技术相关的一种或多种困难或缺 陷。

【发明内容】

[0011] 于2012年6月1日和2012年9月7日提交的、题为"NovelOrganisms"的美国 专利申请一一其全部公开内容以引用的方式纳入本文一一描述了在多种生物中使用多种 共生生物的方法以及在培育过程早期选择改善的共生相容性和性能的方法。即，从头开始 培育共生生物-生物基因型组合并筛选包括改善的共生体相容性和性能的所需特性。为促 进这一点，申请人已开发了用于通过人工种子生产和接种方法大规模建立共生体的方法。
[0012] 因此，在本发明的第一方面，提供了用于制备人工种子的方法，所述方法包括：
[0013] 提供植物种子来源；
[0014] 将所述种子进行表面消毒；
[0015] 从所得表面消毒的种子中分离种子胚；和
[0016] 用包衣包被所述胚以形成人工种子。
[0017] 所述种子可来自任何合适的植物。所述植物可以是禾本科植物，优选多年生禾本 科植物、豆科植物、藤本植物、灌木、乔木、草本植物、花、灌木或灌木丛。依据本发明这一方 面的方法特别适用于禾本科植物和豆科植物。
[0018] 可用任何合适的技术将所述种子进行表面消毒。优选地，通过使用酸（如盐酸）和 漂白剂（如次氯酸钠）处理所述种子对其进行消毒。优选地，依次进行所述酸处理和漂白 剂处理。所述酸处理可持续1小时至24小时的时间，优选过夜。所述漂白剂处理可持续5 分钟至1小时的时间，优选约20分钟。可连续几日进行两次所述漂白剂处理，同时例如使 用无菌蒸馏水洗涤经处理的种子，并将其保存在约4至30°C，优选约24°C。
[0019] 可通过本领域技术人员已知的技术从处理过的种子中分离胚。
[0020] 在一个优选的实施方案中，可处理所述胚以形成一个或多个共生生物（例如，内 生菌）的进入点。例如，可穿刺所述胚或破坏其表面，例如通过擦伤或蚀刻，从而促进共生 生物的进入。在一个特别优选的实施方案中，可以使用皮下注射针头或类似物在所述胚表 面产生单个或多个穿孔。
[0021] 所述包衣可以是用于包裹所述胚的任何合适的类型，包括藻酸盐、琼脂、polyco 2133、羧甲基纤维素、角叉菜胶、结冷胶（gelrite)、瓜尔胶、果胶酸钠、黄蓍胶等。在一个优 选的实施方案中，所述包衣是藻酸盐，更特别是藻酸钙。
[0022] 在一个优选的实施方案中，可将所述胚与所述包衣混合并且将含单个胚的包衣液 滴置于聚合溶液如氯化钙溶液中，优选同时进行搅拌，以形成人工种子。可在约1至60分 钟搅拌后收集人工种子，优选在约15分钟搅拌后。
[0023] 在一个优选的实施方案中，可在包衣前用共生生物如内生真菌接种所述胚。在一 种优选的形式中，可用内生菌菌丝体直接接种所述胚。
[0024] 或者，在一个特别优选的实施方案中，可将分离的胚用含共生生物的包衣层（如 含内生真菌的包衣层）包被。
[0025] 在该实施方案中，所述接种步骤可包括：
[0026] 提供种子胚来源；
[0027] 用一种或多种共生生物如内生真菌接种所述胚；和
[0028] 用包衣包被所述经接种的胚以形成人工种子。
[0029] 或者，所述接种步骤可包括：
[0030] 提供种子胚来源；和
[0031 ] 用含共生生物如内生真菌的包衣包被所述胚以形成人工种子。
[0032] 在一个优选的实施方案中，可用第二包衣层双层包被所述种子。优选地，所述第二 包衣层为藻酸盐，更优选为藻酸钙，甚至更优选为有色藻酸钙。在一个优选的实施方案中， 可将所述具有第一包衣层的人工种子在用第二层包被之前进行风干。
[0033] 在一个优选的实施方案中，本方法还包括用第二包衣层包被所述人工种子，所述 第二包衣层优选包含添加的适于维持所述胚和/或共生生物的营养物。
[0034] 或者，所述第二包衣层可不含添加的营养物，该不含营养物的层被设计用于，例 如，降低内生菌在萌发过程中的向外生长（out-growth)并将内生菌的生长限制在该胚周 围。
[0035] 在本发明的另一方面，提供了选自以下的人工种子：
[0036] (a)植物胚，其接种了一种或多种共生生物的植物胚并被包衣包被以包裹所述胚； 和
[0037] (b)植物胚，其被含共生生物的包衣层包被。
[0038] 优选地，所述人工种子用第二包衣层进行双层包被。如本文所述，第二包衣层可包 括添加的营养物或可是不含营养物的层。
[0039] 优选地，所述胚来自选自禾本科植物和豆科植物的植株。优选地，通过上文所述的 技术分离所述胚。优选地，将所述胚进行处理以形成共生生物的一个或多个进入点。
[0040] 在一个特别优选的实施方案中，共生生物可为内生真菌。
[0041] 在另一个特别优选的实施方案中，可通过上文所述的方法产生所述人工种子。
[0042] 在一个优选的实施方案中，本发明的方法还可包括：
[0043] 培养所述人工种子以形成小植株或幼苗；和
[0044] 从所述小植株或幼苗中筛选共生生物的存在，如内生真菌的存在。
[0045] 可使用任何合适的生长培养基进行培养所述人工种子的步骤。特别优选萌发培养 基如MS(MurashigeandSkoog)、改良MS或MS+BAP(6-苄基氨基嗓呤）。
[0046] 例如，可筛选所述幼苗的共生生物-特异性的，例如内生真菌-特异性的简单序列 重复（SSR)。
[0047] 已进行了大规模的内生菌发现项目以建立内生真菌菌株的"文库"。已经建立了多 年生黑麦草和高羊茅的种质（accession)的库（collection)。
[0048] 可利用于2012年6月1日提交的、题为"NovelEndophytes"的澳大利亚专利申 请中描述的技术选择所选择的用于接种所述胚的内生菌，所述申请的全部公开内容以引用 的方式纳入本文。特别优选其中所述的新型内生菌。
[0049] 对这些种质中的内生菌的遗传分析已导致鉴定出大量新型内生菌菌株。这些新型 内生菌菌株在基因上不同于已知内生菌菌株。可以进行代谢谱分析以确定这些菌株的毒素 谱。
[0050] 用SSR标记物对植物中的内生菌的特异性检测可被用于确认人工接种至例如植 物、植物株系、植物品种和植物栽培种中的内生菌菌株的存在和种类。
[0051] 可通过遗传分析和/或代谢谱分析筛选所述经接种的种质（germplasm)。例如，可 使用题为"NovelEndophytes"的澳大利亚临时专利申请中描述的遗传分析技术。
[0052] 可选地，或另外地，可对所述经接种的种质进行遗传分析（遗传表征）以证明与已 知的共生生物-基因型的共生体的基因区别，并确认共生生物（例如，人工接种至例如植 物、植物株系、植物品种和植物栽培种中的内生真菌、菌株）的种类。
[0053] "遗传分析"意指分析所述共生生物如内生真菌的细胞核DNA和/或线粒体DNA。
[0054] 该分析可包括检测多态性标记物如简单序列重复（SSR)或接合型标记物的存在 或缺失。SSR，也称为微卫星，是基于串联重复的1-7个核苷酸核心元件，更常见地1-4个核 苷酸核心元件。所述SSR阵列嵌入在复杂的侧翼DNA序列中。微卫星的出现被认为是由于 复制滑动的性质造成的，在复制滑动中DNA聚合酶中止并沿其模板短暂滑动，从而使得短 的相邻序列产生重复。一些序列基序比其他序列基序更易于滑动，产生了基于不同基序类 型的SSR位点的相对数量的变化。由于进一步滑动和/或不平等姐妹染色单体交换，一旦 被复制，所述SSR阵列可进一步扩张（或收缩）。SSR位点的总数很高，以至于原则上这些 位点能够为任何联锁基因提供标签。
[0055] 由于重复数目的变化，SSR是高度多态性的并且是共显性遗传的。其检测是基于 聚合酶链式反应（PCR)，仅需要少量DNA并适合自动化。它们普遍存在于真核生物基因组 (包括真菌和植物基因组）中，并且已被发现在植物基因组中每21至65kb出现一次。因 此，SSR是广泛应用如遗传多样性分析、基因型鉴定、基因组定位、性状定位和标记物辅助选 择的理想的标记物。
[0056] ZijlldeJongetal(2003)Genome46 (2) : 277-290 记载了 已知的可被用于研宄 多年生黑麦草中内生菌多样性的SSR标记。
[0057] 可选地，或另外地，所述遗传分析可包括测序基因组DNA和/或线粒体DNA以及进 行序列比较以评估共生生物如内生