化的或基本自动化的。
[0094] 因此，所述方法可包括筛选共生体的所需特性的存在，所述方法包括对共生体群 进行分子表型分析。
[0095] 在一个优选的实施方案中，所述方法可包括评估共生体群的生物碱产量和/或水 溶性碳水化合物（WSC):蛋白质比例。优选地，使用一种或多种选自酶测定法、比色测定法、 SSR标记物和代谢组学分析的方法进行所述评估。
[0096] 在一个优选的实施方案中，评估生物碱产量包括在该群中测定生物碱谱和/或含 量。优选的生物碱包括波胺、黑麦草震颤素B和麦角瓦灵。在一个优选的实施方案中，生物 碱可由SSR标记物推断并可通过代谢组学分析检测，更优选使用SSR标记物和代谢组学分 析的组合。
[0097] 在另一个优选的实施方案中，可评估WSC:蛋白质比例。可使用酶测定法对WSC进 行定量。在一个优选的实施方案中，可确定蔗糖、葡萄糖、果糖和果聚糖的各自浓度。可使 用比色测定法对蛋白质进行定量。
[0098] 在一个特别优选的实施方案中，可通过包括如下的方法对蛋白质进行定量：
[0099] 使用碱（如NaOH，优选稀NaOH溶液）从共生体中提取蛋白质；
[0100] 利用比色测定法如Bradford测定法对蛋白质进行定量。
[0101] 可例如使用酶标仪（platereader)进行检测。
[0102] 所述共生体可以是任何合适的形式，包括接种的胚、植物种子、萌发的种子、幼苗、 小植株、植株等。
[0103] 优选地，所述种子衍生自被共生生物感染的（例如被内生菌感染的）植物，如植物 /内生菌共生体。
[0104] 在依据本发明这一方面的方法中，所述筛选步骤可包括通过加速老化筛选人工种 子，其记载于2012年6月1日提交的题为"Method for selection of stable symbiota" 的澳大利亚专利申请中，所述申请的全部公开内容以引用的方式纳入本文。
[0105] 该专利申请记载了评估植物-共生生物的共生体（例如植物/内生菌共生体）的 相容性和/或稳定性的方法，所述方法包括：
[0106] 提供包括共生生物的种子的来源，如被内生真菌接种的植物胚；和
[0107] 通过向其施用加速老化来筛选所述种子和/或其后代的所述植物/共生生物联合 体（即，共生体）（如植株-内生真菌共生体）的相容性和/或稳定性。
[0108] 在所述加速老化过程中，可将所述人工种子或其后代置于恶化条件下，优选地通 过高温和/或增加的水含量。在一个特别优选的实施方案中，可将所述种子暴露于高相对 湿度的环境中。例如，可将所述种子在例如约1至30天，优选2至10天，更优选4至7天 的时间段内，暴露于约-20至50°C，优选10至45°C，更优选15到40°C，甚至更优选25至 40 °C的温度和/或约60 %至100%，优选80 %至100 %的湿度水平。
[0109] 加速老化降低共生生物例如内生菌的生活力，即，其使得能够反向选择不稳定的 联合体并允许基于其稳定性将共生体排序。
[0110] 优选地，所述方法包括将所选择的共生体群进行快速共生体如内生真菌生活力测 定的额外步骤。
[0111] 因此，本发明的方法还可包括评估植物共生生物联合体（即，共生体）（如植 物-内生真菌共生体）的相容性和/或稳定性，其包括：
[0112] 提供包括共生生物的种子的来源，例如被内生真菌接种的植物胚；
[0113] 通过向其施用加速老化筛选所述种子和/或其后代的所述植株/共生生物联合体 (即，共生体）（如植株-内生真菌共生体）的相容性和/或稳定性；和
[0114] 将所选择的共生体群进行快速共生生物如内生真菌生活力测定。
[0115] 依据本发明这一方面的生活力测定步骤可包括：
[0116] 培养所述种子以产生小植株、幼苗或萌发的种子；
[0117] 从所述小植株、幼苗或萌发的种子中提取DNA和/或RNA;和
[0118] 将所提取的DNA和/或RNA进行用于植物中表达的共生生物-特异性基因（例如 内生真菌-特异性基因）的测定。
[0119] 优选地，所述种子衍生自被共生生物接种的植株，例如被内生真菌接种的植株。
[0120] 优选地，所述种子是如上文所述的人工种子。
[0121] 所述种子可来自任何合适的植株。该植株可为禾本科植物，优选多年生禾本科植 物、豆科植物、藤本植物、灌木、乔木、草本植物、花、灌木或灌木丛。依据本发明这一方面的 方法特别适用于禾本科植物和豆科植物。
[0122] 所述快速内生菌生活力测定法记载于2012年6月1日提交的题为"Methodfor rapidendophyteviabilityassessment"的澳大利亚专利申请，所述申请的全部公开内容 以引用的方式纳入本文。
[0123] 优选地，将所述种子培养一段相对较短的时间，从而可获得对共生生物生活力如 内生真菌生活力的快速评估。优选地，将所述种子培养约1至10天，更优选3至10天，更 优选3至7天，更优选3至5天。
[0124] 申请人已经发现共生生物特异性基因（例如内生菌特异性基因）在该时间范围内 表达，使得早期植物中共生生物生活力评估得以进行。
[0125] 在一个优选的形式中，所述DNA/RNA可提取自幼苗的叶，更优选幼苗的上胚轴、下 胚轴或相似的胚莖（embryonicshoot)。在禾本科植物中，所述DNA/RNA可提取自分蘖。在 另一个优选的形式中，所述DNA/RNA可提取自整个萌发的种子。
[0126] 优选地，可共提取所述RNA和DNA，优选在单一步骤中。优选地，为了加速该过程， 可从1至10日龄、优选3至10日龄、更优选3至7日龄、更优选3-5日龄的幼苗的上胚轴、 下胚轴或相似的胚茎中提取所述DNA/RNA。
[0127] 所述测定可以是用于扩增并同时定量所提取的DNA/RNA中的靶DNA/RNA分子的测 定。优选地，所述测定是实时定量聚合酶链式反应（Q-PCR/qRT-PCR)测定，或动态聚合酶链 式反应（KPCR)测定。在一个特别优选的形式中，所述测定可为TaqMan或类似的测定。
[0128] 所述共生生物特异性基因如内生菌特异性基因可以是任何合适的类型。优选地， 其仅在、高度或主要在植物中表达。特别优选编码蛋白质7490、8263、0005和2232的内生 真菌基因。
[0129] 设计引物用于通过本领域技术人员已知的方法扩增所述靶基因。
[0130] 所述种子可来自任何合适的植物。所述植物可为禾本科植物，优选多年生禾本科 植物、豆科植物、藤本植物、灌木、乔木、草本植物、花、灌木或灌木丛。依据本发明这一方面 的方法特别适用于禾本科植物和豆科植物。
[0131] 优选地，所述种子衍生自被共生生物感染的植物如被内生真菌感染的植物，例如 植物/内生菌共生体。
[0132] 依据本发明这一方面的方法还可包括对所选择的共生体群进行表型分析，以评估 共生体性能和/或保持所需特征；以及选择共生体用于多系杂交，以产生合成的共生体品 种，例如通过多系杂交。
[0133] 例如，可将所选择的共生体品种用于共生体鉴定测定，如内生菌鉴定测定，之后进 行多系杂交以产生下一世代种子。任选地，可以重复以上步骤以确认共生体的稳定性、所需 特征、共生体（例如内生真菌）的种类和/或共生生物（例如内生真菌）在下一种子世代 中的存在（incidence)。
[0134] 因此，在本发明的另一方面，提供了改进的共生体，其包括利用上述方法产生的含 有一种或多种共生生物（如内生真菌）的一种或多种植物。
[0135] 所述植物可以是禾本科植物、乔木、花、草本植物、灌木或灌木丛、藤本植物或豆科 植物，或其产物。
[0136] 可重复以上所述的方法步骤以开发共生体种子或植株的后代。
[0137] 在其他方面，本发明提供了衍生自本发明的人工种子或含共生生物的植株并被共 生生物如内生真菌稳定感染的植物、植物种子或其他植物部分。
[0138] 优选地，所述植物细胞、植株、植物种子或其他植物部分是禾本科植物，更优选是 饲草、草皮或生物能源草，例如黑麦草属和羊茅属的那些，包括多年生黑麦草（Lperenne) 和_状羊茅（Larundinaceum)以及臂形草属（Brachiaria)和尾样草属（Urochloa) 的那些，包括珊状臂形草（B.brizantha)、俯仰臂形草（B.decumbens)、湿生臂形草 (B.humidicola)和莫桑比克尾样草（U.mosambicensis)。
[0139] "植物细胞"意指任何受半透膜约束并包含质体的自我繁殖的细胞。如果需要进一 步繁殖，这类细胞还需要细胞壁。本文使用的植物细胞包括但不限于，种子悬浮培养物、胚、 分生组织区域、愈伤组织、叶、根、芽（shoot)、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
[0140] 除非上下文另有说明，本文使用的术语"包含（comprise)"及该术语的变体，如 "包含（comprising)" "包含（comprises)"和"包含（comprised)"，并不旨在排除其他添加 剂、成分、整体或步骤。
[0141] 在此说明书中对任何现有技术的引用都不是也不应被看作是承认或以任何形式 暗示该现有技术在澳大利亚或任何其他管辖区域中构成公知常识的一部分，或该现有技术 可合理地被本领域技术人员预期确定、理解为是相关的。
【附图说明】
[0142] 在附图中：
[0143] 图1示出了通过使用具有不含添加的营养物的藻酸钙基质的包衣将多年生黑麦 草胚进行藻酸钙包被而产生的人工种子。
[0144] 图2示出了利用具有有色的藻酸钙基质的包衣将多年生黑麦草胚用藻酸钙包被 成人工种子。用QueenGreen(90610)着色的多年生黑麦草的人工种子；a)风干的人工种 子；b)置于萌发培养基的人工种子。用QueenPink(90610)着色的多年生黑麦草的人工种 子；c)风干的人工种子；d)置于萌发培养基的人工种子。
[0145] 图3示出了利用具有多个藻酸钙基质层的包衣将多年生黑麦草胚用藻酸钙包被 成人工种子。a)用具有添加的营养物的第一包衣（未着色的）藻酸钙层（层A)包被的多 年生黑麦草的人工种子。b)用具有添加的营养物的两个（第一层A;未着色的以及第二层 B;用QueenGreen着色的）藻酸钙层包被的多年生黑麦草的人工种子；c)置于萌发培养基 的双层包衣的人工种子。
[0146] 图4示出了利用具有多个藻酸钙基质层的包衣将多年生黑麦草用藻酸钙包被成 人工种子。a)-c)用第一包衣（无色的）藻酸妈层（层A)和带有Queen-Pink或Queen-Green 着色的藻酸钙层（层B)的第二包衣包被的多年生黑麦草的人工种子的横截面。d)_e)用第 一包衣（未着色的）藻酸钙层（层A)和带有Queen-Green着色的藻酸钙层（层B)的第二 包衣包被的多年生黑麦草的人工种子的横截面。
[0147] 图5示出了多年生黑麦草栽培变种BronsynE-(不含内生菌，2668种批）的种子、 胚和人工种子的萌发。a)原始种子：滤纸上萌发频率为1 %;b)表面消毒的种子：滤纸上萌 发频率为10% ;c)分离的胚：萌发培养基上萌发频率为48% ;d)人工种子（带有萌发培养 基）：MS培养基上萌发频率为40%。
[0148] 图6示出了多年生黑麦草栽培变种BronsynE+(含内生菌，2667种批）的种子、胚 和人工种子的萌发。a)原始种子：滤纸上萌发频率为10% ;b)表面消毒的种子：滤纸上萌 发频率为30% ;c)分离的胚：萌发培养基上萌发频率为90% ;d)人工种子（带有萌