一种快速获得日本结缕草组培苗的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物的组织培养领域，具体涉及一种快速获得日本结缕草组培苗的方 法。
【背景技术】
[0002] 结缕草为多年生草本植物，隶属于禾本科虎耳草亚科。一般认为有11个种及部分 变种，而作为草坪草种质资源被研宄利用的有5个种。其中的日本结缕草是重要的草坪草， 它很多的优良特性，如适应性广、抗旱性强、耐磨耐践踏、耐热耐盐碱等，使得它被广泛运用 于城市运动场、城市绿化、公路护坡及水土保持。
[0003] 然而绿色期短的缺点限制了日本结缕草进一步的扩大应用。并且结缕草为四倍体 植株，授粉方式为雌雄同株异花型。传统育种的方式很难改良绿色期短的性状，并且也难于 获得品系较纯，遗传背景一直的日本结缕草种子。应用转基因的技术筛选培育符合生产需 求的品种就有着巨大的优势。
[0004] 应用转基因手段改良物种的基础是建立高效优质的再生体系，在这方面已经有很 多的学者进行了研宄。Al-khayri等用日本结缕草成熟胚诱导了愈伤组织，从而得到再生植 株；Inokuma通过培养日本结缕草悬浮细胞系，进而纯化得到原生质体再生株系；Noh等人 以结缕草的幼穗、茎尖为外植体材料诱导愈伤组织，并获得了再生植株。但这些办法的周期 过长，诱导出胚性愈伤组织通常需要3个月以上的时间，再由胚性愈伤组织长成植株可能 要半年左右的时间，这增大了分子育种工作者筛选和选育优良植物品系的周期。Yaxin Ge 等人用日本结缕草的匍匐茎做的再生体系，大大缩短了时间，在报道中，2月左右的时间就 能获得转基因植株。但植物体内的内生菌难以消除，从而大大影响了基因转化的效率。本课 题组构建的再生体系，能保证快速获得再生植株（50天左右），也同时避免了染菌的问题。
【发明内容】
[0005] 为加快日本结缕草组培苗的建成过程，提高生产效益，本发明的目的在于提供一 种快速获得日本结缕草组培苗的方法。
[0006] 本发明提供的快速获得日本结缕草组培苗的方法，包括如下步骤：
[0007] 1)将灭菌的日本结缕草种子以水浸种3天；
[0008] 2)浸种后的种子吹干至表面发白，以刚没过种子的水培养至萌发出l-2mm的芽；
[0009] 3)将萌芽后的种子接种到固体MS (Murashige and Skoog)培养基上，培养至幼苗 地上部高3cm，此时幼苗叶鞘底部出现表面粗糙的节点；
[0010] 4)剥去幼苗上的种皮，沿节点上沿切断幼苗，注意保留节点，去除节点以上的茎 叶，将余下的植株放到ZJ-SM培养基上，培养至茎端长出芽；
[0011] 5)去除茎端长出的芽，将植株放回ZJ-SM培养基上继续培养至根端长出芽；
[0012] 6)将根端长出的芽切下放到固体1/2MS培养基上培养至长出5cm长的根，得到完 整的植株；
[0013] 7)将完整的植株炼苗后移植，得到日本结缕草组培苗。
[0014] 其中，所述的水优选为无菌水。
[0015] 其中，步骤1)所述灭菌的方法为：将种子加入灭菌液后搅拌40min，用水漂洗3-5 次后去除表面水分。
[0016] 所述去除表面水分，为吹干或用无菌滤纸吸干水分。
[0017] 所述灭菌液为Tween-20含量为2. 500ml/L、次氯酸钠原液含量为250ml/L的水溶 液。
[0018] 其中，所述ZJ-SM培养基为含激动素（kinetin)的浓度为1.0-8.0ymol/L、含 2,4-D的浓度为0.1 ymol/L、蔗糖质量百分含量为2%、植物凝胶的含量为0.3%(w/v)的 固体MS培养基。
[0019] 所述激动素的浓度优选为4. 0-6. 0 ymol/L，最优选为4. 0 ymol/L〇 [0020] 其中，步骤2)所述培养至萌发出l-2mm的芽，所需时间为3天。
[0021] 其中，步骤3)所述培养至幼苗株高3cm，所需时间为12天。
[0022] 其中，步骤4)所述培养至茎端长出芽，所需的时间为4天。
[0023] 其中，步骤5)所述培养至根端长出芽，所需的时间为15天。
[0024] 其中，步骤6)所述培养至长出根，所需的时间为10天。
[0025] 其中，步骤7)所述炼苗，所需时间为3天。
[0026] 其中，所述培养的培养条件为白天温度28-30°C，夜间温度24-26°C，光照时间16 小时/天，光照强度30001x。
[0027] 本发明还提供所述快速获得日本结缕草组培苗的方法在日本结缕草良种繁育中 的应用。
[0028] 本发明的有益效果在于提供了一种结缕草快速再生的办法，传统的通过愈伤而获 得再生植株的办法一般需要4个月左右，而本发明只需要50天，大大缩短了获得再生植株 的周期，为结缕草的转化体系研宄提供了基础。以本发明的方法能快速制备结缕草无性系 的植株，以便转基因工作者能有遗传背景一致的外植体进行基因研宄。本发明的方法还能 完成日本结缕草的快速扩繁。
[0029] 3)能将转基因结缕草进行快速的扩繁。
[0030] 本发明的关键点如下：
[0031] 1)制备无菌外植体时，一般用于消毒的酒精，次氯酸等消毒的化学药剂会对植株 造成很大的伤害，甚至可能发生诱变而影响植株的再生。本发明是在种子时期进行灭菌的， 此时的种子有坚硬厚实的种皮保护而抵挡了清毒处理时，化学药剂对植物的伤害。
[0032] 2)本发明的灭菌过程保留种子的种皮且灭菌液中需加入少量表面活性剂，这样可 以延长灭菌的时间，且充分去除种子表面附着的菌而达到了消毒的效果。
[0033] 3) ZJ-SM培养基中的激动素及2, 4-D的含量为微量，使得结缕草长芽而又不会诱 导出愈伤组织。
[0034] 4)在切除节点时，保留切口处有小绿点的部分，因为小绿点是能分化成整个植株 的生长点。
[0035] 5)除芽，外植体在ZJ-SM培养基上培养时，第一次冒出的芽要去除（一般从外植体 顶端冒出）。此时得芽并不是新长出的，而是植物本身含有。
【附图说明】
[0036] 图1为实施例4萌发出l_2mm小芽的种子的照片。
[0037] 图2为实施例4幼苗叶鞘底部节点的照片。
[0038] 图3为实施例4幼芽生根的照片。
[0039] 图4为实施例4炼苗和移植的照片。
【具体实施方式】
[0040] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0041] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0042] 实施例1ZJ-SM培养基配方浓度筛选
[0043] ZJ-SM培养基中，激动素的作用是促进组织分化、生芽，2, 4-D起着生长素的作用， 促进不定根形成，促进生长。ZJ-SM培养基中激动素（kinetin)浓度和2, 4-D浓度的筛选实 验如下：
[0044] 筛选激动素浓度：
[0045] 在含鹿糖质量百分含量为2 %、植物凝胶的含量为0? 3 % (w/v)的固体MS培 养基上梯度设置含激动素的浓度为I. 〇 umol/L、2. 0 ymol/L、3. 0 ymol/L、4. 0 ymol/L、 5. 0 y mol/L、6. 0 y mol/L、7. 0 y mol/L、8. 0 y mol/L 及 0? 0 y mol/L (对照）。在上述培养基 上接种日本结缕草外植体，并统计出芽率。
[0046] 所述外植体的获得方法如下：将灭菌的日本结缕草种子萌芽后在固体MS培养基 培养至地上部高3cm，此时幼苗叶鞘底部出现表面粗糙的节点，剥去幼苗上的种皮，沿节点 上沿切断幼苗，注意保留节点，去除节点以上的茎叶，余下的含有节点的部分为外植体。
[0047] 培养19天后得到的出芽率结果如下：
[0048] 表1激动素浓度对出芽率的影响
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[0050] 从上述结果来看，加入激动素能大大增加植物出芽的数量。1.0 ymol/ L-8. 0 ymol/L浓度的激动素，诱导芽的效果都较好。在4. 0 ymol/L-6. 0 ymol/L间，诱导出 芽的效率稳定，并且效率很高，三次重复都在55%以上。4. 0 y mol/L的效果最好，三次重复 实验都有最高的出芽率。
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