051] 筛选2,4-D浓度：
[0052] 在含激动素（kinetin)的浓度为4.0ymol/L，蔗糖质量百分含量为2%、植物凝胶 的含量为0.3% (w/v)的固体MS培养基上接种日本结缕草外植体筛选2, 4-D的浓度，发现 在0? I y mol/L的时候，没有愈伤组织的形成，在含I y mol/L 2, 4-D的情况下，会有部分外 植体形成了愈伤组织，而在10 U mol/L及以上时，外植体基本都诱导出了愈伤组织。植物诱 导出了愈伤组织，不利于芽的诱导。因此我们用0. lumol/L 2,4-D来分析它对不定根形成 的影响：
[0053] 设置培养基为含激动素的浓度为4. 0ymol/L、含2,4-D的浓度为0? Iymol/L、 蔗糖质量百分含量为2 %、植物凝胶的含量为0.3 % (w/v)的固体MS培养基和对照（不 含2,4-D，即含激动素的浓度为4.0 ymol/L、蔗糖质量百分含量为2%、植物凝胶的含量为 0.3% (w/v)的固体MS培养基）在其上接种日本结缕草外植体，培养至茎端长出芽，去除茎 端长出的芽，将植株放回ZJ-SM培养基上继续培养至根端长出芽；将根端长出的芽切下放 到固体1/2MS培养基上培养至第10天，结果见表2,我们发现添加2,4-D后生根的效率得到 了显著提高。
[0054] 表2添加2, 4-D对生根情况的影响
[0055]
[0056] 实施例2种子培养方式筛选
[0057] 将灭菌的日本结缕草种子以4°C的水浸种3天（72小时），将种子吹干至表面发 白，之后设置直接接种到MS培养基上培养和以刚没过种子的水培养两种方式，培养温度均 为室温培养。
[0058] 据观察发现，种子泡在水中，会有少量种子在2天内发芽，在第3天，大部分种子都 能发芽了。而直接播在MS培养基中的种子，发芽的最快时间是第3天，大量的种子会在4-5 天发芽。
[0059] 实施例3播种密度筛选
[0060] 配置固体MS培养基，分装于直径8cm的组培瓶中，每瓶约30ml。
[0061] 将4°C浸种72小时后的种子吹干至表面发白，以刚没过种子的水培养至萌发出 l-2mm的芽，按每瓶10粒、20粒、30粒、40粒、50粒的播种密度接种到上述装有固体MS培 养基的组培瓶中，培养15天，观察后没有发现播种密度对日本结缕草的生长情况有明显影 响。
[0062] 实施例4快速获得日本结缕草组培苗的方法
[0063] 1)2015年1月23日，将日本结缕草种子（品种：zenith)放入50ml离心管中，加入 40ml灭菌液（含有IOOulTween-20,IOml次氯酸钠原液），在双向磁力搅拌器上搅拌40min 后，用无菌水漂洗种子3-5次，之后去除表面水分（将种子吹干或用无菌滤纸充分吸干水分 的效果一样）以保障有效地杀菌，并侵泡在无菌水中，4°C放置72小时。
[0064] 2)1月26号，将水倒掉，之后将种子吹干至种子表面发白，这样有利于种子萌发。 将种子转入灭菌的培养皿中，加入少量无菌水，使其刚好没过种子，置于室温，无菌条件下 培养。
[0065] 3)1月29日，大部分种子开始萌发出l-2mm小芽，具体见图1。将萌发的种子转入 固体MS培养基中（事先配置固体MS培养基，分装于直径8cm的组培瓶中，每瓶约30ml)，一 个组培瓶放10粒种子（放20粒的培养效果与放10粒一样），温室，无菌培养。
[0066] 4)2月8日，幼苗地上部高3cm，此时幼苗叶鞘底部（根与茎相连处）出现表面粗糙 的节点，参见图2,这一节点具有分化成完整植株的能力。将幼苗取出，剥去幼苗上的种皮， 沿节点上沿切断幼苗，注意保留节点，去除节点以上的茎叶，将余下的植株放到ZJ-SM培养 基上，培养至茎端长出芽；所述ZJ-SM培养基为含激动素（kinetin)的浓度为4.0ymol/L、 含2,4-D的浓度为0.1 ymol/L，鹿糖（sucrose)质量百分含量为2%、植物凝胶（phytagle) 的含量为0.3% (w/v)的固体MS培养基。
[0067] 5)2月12日，外植体顶端长出芽（这一步的芽是植株本身就有的），将芽切除，放 回ZJ-SM培养基上。
[0068] 6) 2月27日，外植体底部长出了新芽（这一步的芽则是从生长点开始完全新长出 来的）。将芽完整取下，转移到1/2固体MS培养基中。
[0069] 7)3月9日，幼芽生根并且长到5cm左右，见图3,将植株进行炼苗，见图4左侧。
[0070] 8)3月12日，将植株移植到土中种植，见图4右侧。移栽到土里后很有可能出现萎 蔫的现象，在植株适应了外界环境之前，土壤一定要注意保持充足水量。
[0071] 各步骤的培养条件为白天温度28-30°C，夜间温度24-26°C，光照时间16小时/ 天，光照强度3000lx。
【主权项】
1. 一种快速获得日本结缕草组培苗的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 将灭菌的日本结缕草种子以水浸种3天； 2) 浸种后的种子吹干至表面发白，以刚没过种子的水培养至萌发出l_2mm的芽； 3) 将萌芽后的种子接种到固体MS培养基上，培养至幼苗地上部高3cm，此时幼苗叶鞘 底部出现表面粗糙的节点； 4) 剥去幼苗上的种皮，沿节点上沿切断幼苗，注意保留节点，去除节点以上的茎叶，将 余下的植株放到ZJ-SM培养基上，培养至茎端长出芽； 5) 去除茎端长出的芽，将植株放回ZJ-SM培养基上继续培养至根端长出芽； 6) 将根端长出的芽切下放到固体1/2MS培养基上培养至长出5cm长的根，得到完整的 植株； 7) 将完整的植株炼苗后移植，得到日本结缕草组培苗。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水为无菌水。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述灭菌的方法为：将种子加入灭 菌液后搅拌40min，用水漂洗3-5次后去除表面水分。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述去除表面水分，为吹干或用无菌滤纸吸 干水分。5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述灭菌液为Tween-20含量为2. 500ml/L、 次氯酸钠原液含量为250ml/L的水溶液。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ZJ-SM培养基为含激动素的浓度为 I. 0-8.Oymol/L、含2, 4-D的浓度为0?Iymol/L，蔗糖质量百分含量为2%、植物凝胶的含 量为0.3% (w/v)的固体MS培养基。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ZJ-SM培养基为含激动素的浓度为 4. 0-6. 0ymol/L、含2, 4-D的浓度为0?Iymol/L，蔗糖质量百分含量为2%、植物凝胶的含 量为0.3% (w/v)的固体MS培养基。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ZJ-SM培养基为含激动素的浓度为 4. 0ymol/L、含2, 4-D的浓度为0?Iymol/L，蔗糖质量百分含量为2%、植物凝胶的含量为 0.3% (w/v)的固体MS培养基。9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述培养至萌发出1-2_的芽，所需 时间为3天；步骤3)所述培养至幼苗株高3cm，所需时间为12天；步骤4)所述培养至茎端 长出芽，所需的时间为4天；步骤5)所述培养至根端长出芽，所需的时间为15天；步骤6) 所述培养至长出根，所需的时间为10天；步骤7)所述炼苗，所需时间为3天。10. 权利要求1-9任一项所述的方法在日本结缕草良种繁育中的应用。
【专利摘要】本发明具体提供一种快速获得日本结缕草组培苗的方法，包括如下步骤：1)灭菌种子浸种3天；2)浸种后的种子吹干，以水培养至萌发出1-2mm的芽；3)萌芽后的种子接种到固体MS培养基上，培养至幼苗地上部高3cm，此时幼苗叶鞘底部出现表面粗糙的节点；4)剥去种皮，去除节点上方的茎叶，将余下的植株以ZJ-SM培养基培养至茎端长出芽；5)去除茎端长出的芽，放回ZJ-SM培养基上继续培养至根端长出芽；6)将根端长出的芽切下放到固体1/2MS培养基上培养至长出根，得到完整的植株；7)将完整的植株炼苗后移植，得到组培苗。相比于愈伤组织再生体系的方法，本发明将4个月缩到了50天，大大缩短了日本结缕草的繁殖周期。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN104885938
【申请号】CN201510271876
【发明人】韩烈保, 谢琦, 袁建波, 张胤冰, 樊波
【申请人】北京林业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日