一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种根结线虫的培养方法，具体地说是涉及一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法。
【背景技术】
[0002]花生是世界上广泛种植的经济作物之一，是我国第二大食用植物油和蛋白质资源。我国北方地区主要是北方根结线虫对花生生产危害严重，尤其是花生大省山东，发病面积最大，损失最严重。受害的花生一般减产在20 % -30 %左右，严重时可达70 % -80 %，甚至绝收(徐秀娟，2009)。花生线虫病是花生生产上的重要病害，迄今为止，仍不能很好的控制线虫病的发生和危害。
[0003]根结线虫侵染花生后，刺激巨型细胞产生，导致花生的根活力下降，阻碍对营养物质的吸收和运输。同时可引起花生叶绿素含量减少，光合强度下降。根结线虫侵染花生以后在侵染的第3d引起花生呼吸强度提高，随后则明显降低。这些生理变化都导致了花生的代谢失常和生理紊乱，最终导致植株矮小、黄化，甚至枯萎死亡(宾淑英，1999)。目前对花生北方根结线虫病的研究局限在植物病理方面，对北方根结线虫的生长发育、遗传特性和代谢途径方面缺乏研究，原因是缺乏北方根结线虫的单外源高效连续培养体系和缺乏能反映出线虫和寄主的互相作用的真实情况的研究体系。
[0004]由于植物寄生线虫、植物宿主和环境之间的关系是极其复杂的，难以评估在土壤中所发生的变化。无菌培养条件下研究它们之间的关系可以反映出植物寄生线虫和植物宿主相互作用真实情况，为一种良好的方法。要研究北方根结线虫，首先要培养得到大量一致的线虫群体。目前植物寄生线虫的无菌培养多采用在愈伤组织或离体根上单外源培养，是研究植物寄生线虫生化和遗传发育特性上常用的方法，缺点在于愈伤组织和离体根透明性差，不便于观察，不能继代培养，影响实验的连续性。这就要求尽快研究出北方根结线虫的单外源高效连续培养体系，为开展花生抗线虫病的研究提供重要技术平台。
[0005]目前，在花生北方根结线虫病抗性鉴定方法研究方面缺乏一个简单、直观方便、重复性好以及不受自然环境影响的抗性鉴定方法。
[0006]病地自然诱发鉴定，受自然条件影响大，每年发病情况都不一样，周期长，费工，占地面积大。室内人工接种鉴定方法虽具有快速等特点，但和生长实践不符合，只能鉴定品种抗扩展特性。
[0007]发根农杆菌能诱导大多数双子叶植物和少数单子叶植物，发根农杆菌所含Ri质粒的T-DNA通过整合进入植物核基因组，并稳定表达引起宿主植物发根。用发根农杆菌侵染花生而获得的发根生长速度快，具有激素自主性，分化水平高，遗传特性稳定，合成能力较强，易于继代培养。发根具有正常根组织结构，符合植物内寄生线虫的生长环境，因此更能反映出线虫和寄主互相作用的真实情况。
[0008]常用的发根农杆菌对花生外植体毛状根诱导能力存在差异。Fabric1等采用3种发根农杆菌ATCC15834、R1000、EHA105均诱导出毛状根。Kim等采用发根农杆菌ATCC15834、A4、R1000、R1200、R1601等菌株诱导发根。国内姚庆收等采用发根农杆菌R1601诱导，子叶没有诱导出毛状根，叶片诱导率达65.6%，茎干诱导毛状根生长缓慢。刘杰等采用发根农杆菌ACCC10060和ATCCl 1325诱导发根，叶片最高诱导率为53.3%。
[0009]Verdejo S.等发现经发根农杆菌转化后的植株具有侧根增多、易于次培养等特点，在用马铃薯和番茄的发根培养瓜哇根结线虫获得较好的效果。Elsen A.等发根体系研究了菌根真菌和咖啡短体线虫的相互作用。Kifle S.等用甜菜发根体系来研究转抗根部专性寄生物基因的表达。Narayanan R.A.用大豆发根体系研究大豆孢囊线虫特性，表明用发根体系可以鉴定大豆抗孢囊线虫基因。Plovie E.等研究了用番茄发根体系鉴定番茄抗线虫特性。肖翔等进行了胡萝卜发根培养甘薯茎线虫体系的研究。阮龙等做了用甘薯、胡萝卜发根体系培养马铃薯腐烂线虫的研究。
[0010]多年来发根一直被用于维持线虫的常规培养和研究植物与寄生物之间的相互关系。运用发根体系检测植物对线虫抗性，已经在甜菜、大豆、马铃薯、番茄和甘薯等作物上使用，但运用花生发根体系培养北方根结线虫还没有人尝试。
【发明内容】
[0011]基于上述技术问题，本发明提供一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法。
[0012]本发明所采用的技术解决方案是:
[0013]—种采用花生发根培养北方根结线虫的方法，包括以下步骤:
[0014]a花生毛状根的制备
[0015]al选取粒大饱满的花育45号种子，经消毒处理，然后用无菌刀在无菌滤纸上剥去种皮，接种于无激素的MSB5培养基上培养；
[0016]a2无菌条件下，用接种环挑取低温冻存的发根农杆菌A4菌株，在LB+50mg/L Kan的固体平板上化线接种，然后置于恒温培养箱中暗培养，待长出单菌落后挑取I个单菌落转入1mlLB液体培养基中，于摇床内暗培养复苏；取0.05ml该菌液于1ml LB液体培养基中再次活化，使其达到对数生长期；
[0017]a3当农杆菌的A600nm = 0.6?0.8时采用发根农杆菌A4侵染步骤al无菌培养6d的花育45号花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养毛状根；
[0018]b北方根结线虫悬液及卵悬液的制备
[0019]bl选取北方根结线虫病发病严重，虫癭多的花生根，用剪刀剪成小段，浸没入NaCLO溶液中，将花生根段弄碎，并搅拌，制成混合液；
[0020]b2将混合液倒入组合筛上，组合筛自上而下依次为40目、200目、325目和500目，用喷壶形成薄雾喷洒40目筛上的混合物，使线虫和卵从根组织内移到表面，喷淋后期使用无菌水；喷淋后，取出325目筛，用无菌水自筛的一侧向另一侧喷淋冲洗，使线虫集中一侧，然后再用少量无菌水从筛背面冲洗筛上物，收集液体到容器获得根结线虫悬液；取出500目筛，用无菌水自筛的一侧向另一侧喷淋冲洗，使线虫集中一侧，然后再用少量无菌水从筛背面冲洗筛上物，收集液体到容器获得卵悬液；
[0021]c北方根结线虫的接种与培养
[0022]无菌条件下，将制备好的根结线虫悬液或卵悬液，均匀接至花生毛状根培养皿，盒盖静置，用膜封口，培养获得大量虫卵和二龄幼虫。
[0023]优选的，步骤al中消毒处理过程如下:先用自来水冲洗花育45号种子20_30min，然后于无菌条件下，用浓度为75%的酒精浸泡0.5-lmin，再在0.1 %升汞中浸泡15min，最后用无菌水洗涤3?4次，每次3-5min。
[0024]步骤al中，所述培养基优选无激素的MSB5培养基，即为MS无机盐+B5有机成分(简称MSB5)，大体包括:MS大量+MS微+MS铁盐+B5有机+蔗糖30g/L+琼脂粉10g/L，pH值为6.00当然上述用于花育45号种子接种的培养基本领域技术人员也可根据经验进行常规选择。
[0025]优选的，步骤a2中:所述发根农杆菌A4菌株在_20°C低温冰箱中冻存；所述恒温培养箱内的温度控制在28 °C;所述LB液体培养基中添加有50mg/L Kan ;所述摇床内培养条件为温度28°C，转速180r/min。
[0026]优选的，步骤bl中:将虫癭多的花生根剪成Icm小段；所述NaCLO溶液的浓度为I % ;所述搅拌时间为lOmin。
[0027]优选的，步骤c中:选取根结线虫悬液Iml或卵悬液Iml接至花生毛状根培养皿；所述盒盖静置时间为Ih ;所述培养温度为25°C，培养时间为42d。
[0028]本发明的有益技术效果是:
[0029]本发明方法繁殖率高、操作简单、不易污染、应用范围广、实用性强，解决了难以获得纯化的大量根结线虫的问题，且避免了盆栽实生苗接种繁殖根结线虫方法的费时、占据大量空间、受季节等自然和环境条件限制以及易被其他生物污染等不足。与常规寄主根系外植体培养法相比，毛状根系外植体更有利于根结线虫的侵染繁殖。
【具体实施方式】
[0030]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明:
[0031]实施例1