[0032]a花生毛状根的制备
[0033]选取粒大饱满的花育45号种子，先用自来水冲洗20min，然后于无菌条件下，用质量百分比浓度为75%的酒精浸泡lmin，再在0.1%升汞中浸泡15min，进行表面消毒，最后用无菌水洗涤3次，每次3min。消毒处理后，用无菌刀在无菌滤纸上剥去种皮，接种于培养基上培养。
[0034]无菌条件下，用接种环挑取于_20°C低温冰箱中冻存的将发根农杆菌A4菌株，在LB+50mg/L Kan的固体平板上化线接种，然后置于28°C恒温培养箱中暗培养，待长出单菌落后挑取I个单菌落转入1ml LB液体培养基(添加50mg/L Kan)中，于28°C、180r/min的摇床内暗培养复苏21h。取0.05ml该菌液于1ml LB液体培养基中再次活化(条件同上)，使其达到对数生长期。使农杆菌的A600nm = 0.6?0.8时采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花育45号花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养毛状根。
[0035]b北方根结线虫悬液的制备
[0036]选取北方根结线虫病发病严重，虫癭多的花生根，用剪刀剪成Icm的小段，浸没入装有质量百分比浓度为1%的NaCLO溶液的大烧杯中，带上无菌手套将含有虫癭的花生根段捏碎，搅拌lOmin，制成混合液。将混合液倒入组合筛上，组合筛自上而下依次为40目、200目、325目和500目。用喷壶形成薄雾喷洒40目筛上的混合物约30min，使线虫和卵从根组织内移到表面，喷淋后期使用无菌水。喷淋后，取出325目筛，用无菌水自筛的一侧向另一侧喷淋冲洗，使线虫集中一侧，然后再用少量无菌水从筛背面冲洗筛上物，收集液体到容器获得根结线虫悬液。用同法冲洗500目筛，可制备获得卵悬液。
[0037]c北方根结线虫的接种与培养
[0038]无菌条件下，将制备好的根结线虫悬液Iml (约100条)或卵悬液Iml (约100个)，均匀接至花生毛状根培养皿，盒盖静置lh，用膜封口。25°C培养42d获得大量虫卵和二龄幼虫。
[0039]实施例2
[0040]a花生毛状根的制备
[0041]选取粒大饱满的花育45号种子，先用自来水冲洗30min，然后于无菌条件下，用质量百分比浓度为75%的酒精浸泡0.5min，再在0.1%升汞中浸泡15min，进行表面消毒，最后用无菌水洗涤4次，每次3min。消毒处理后，用无菌刀在无菌滤纸上剥去种皮，接种于无激素的MSB5培养基上培养。MSB5培养基为MS无机盐+B5有机成分(简称MSB5)。
[0042]无菌条件下，用接种环挑取于-20°C低温冰箱中冻存的将发根农杆菌A4菌株，在LB+50mg/L Kan的固体平板上化线接种，然后置于28°C恒温培养箱中暗培养，待长出单菌落后挑取I个单菌落转入1ml LB液体培养基(添加50mg/L Kan)中，于28°C、180r/min的摇床内暗培养复苏21h。取0.05ml该菌液于1ml LB液体培养基中再次活化(条件同上)，使其达到对数生长期。使农杆菌的A600nm = 0.6?0.8时采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花育45号花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养毛状根。
[0043]b北方根结线虫悬液的制备
[0044]选取北方根结线虫病发病严重，虫癭多的花生根，用剪刀剪成Icm的小段，浸没入装有质量百分比浓度为1%的NaCLO溶液的大烧杯中，带上无菌手套将含有虫癭的花生根段捏碎，搅拌lOmin，制成混合液。将混合液倒入组合筛上，组合筛自上而下依次为40目、200目、325目和500目。用喷壶形成薄雾喷洒40目筛上的混合物约30min，使线虫和卵从根组织内移到表面，喷淋后期使用无菌水。喷淋后，取出325目筛，用无菌水自筛的一侧向另一侧喷淋冲洗，使线虫集中一侧，然后再用少量无菌水从筛背面冲洗筛上物，收集液体到容器获得根结线虫悬液。用同法冲洗500目筛，可制备获得卵悬液。
[0045]c北方根结线虫的接种与培养
[0046]无菌条件下，将制备好的根结线虫悬液Iml (约100条)或卵悬液Iml (约100个)，均匀接至花生毛状根培养皿，盒盖静置lh，用膜封口。25°C培养42d获得大量虫卵和二龄幼虫。
【主权项】
1.一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法，其特征在于包括以下步骤: a花生毛状根的制备 al选取粒大饱满的花育45号种子，经消毒处理，然后用无菌刀在无菌滤纸上剥去种皮，接种于培养基上培养； a2无菌条件下，用接种环挑取低温冻存的发根农杆菌A4菌株，在LB+50mg/L Kan的固体平板上化线接种，然后置于恒温培养箱中暗培养，待长出单菌落后挑取I个单菌落转入1ml LB液体培养基中，于摇床内暗培养复苏；取0.05ml该菌液于1ml LB液体培养基中再次活化，使其达到对数生长期； a3当农杆菌的A600nm = 0.6?0.8时采用发根农杆菌A4侵染步骤al无菌培养6d的花育45号花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养毛状根；b北方根结线虫悬液及卵悬液的制备 bl选取北方根结线虫病发病严重，虫癭多的花生根，用剪刀剪成小段，浸没入NaCLO溶液中，将花生根段弄碎，并搅拌，制成混合液； b2将混合液倒入组合筛上，组合筛自上而下依次为40目、200目、325目和500目，用喷壶形成薄雾喷洒40目筛上的混合物，使线虫和卵从根组织内移到表面，喷淋后期使用无菌水；喷淋后，取出325目筛，用无菌水自筛的一侧向另一侧喷淋冲洗，使线虫集中一侧，然后再用少量无菌水从筛背面冲洗筛上物，收集液体到容器获得根结线虫悬液；取出500目筛，用无菌水自筛的一侧向另一侧喷淋冲洗，使线虫集中一侧，然后再用少量无菌水从筛背面冲洗筛上物，收集液体到容器获得卵悬液；c北方根结线虫的接种与培养 无菌条件下，将制备好的根结线虫悬液或卵悬液，均匀接至花生毛状根培养皿，盒盖静置，用膜封口，培养获得大量虫卵和二龄幼虫。2.根据权利要求1所述的一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法，其特征在于，步骤al中消毒处理过程如下:先用自来水冲洗花育45号种子20-30min，然后于无菌条件下，用浓度为75%的酒精浸泡0.5-lmin，再在0.1 %升汞中浸泡15min，最后用无菌水洗涤3?4次，每次3_5min。3.根据权利要求1所述的一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法，其特征在于，步骤a2中:所述发根农杆菌A4菌株在-20°C低温冰箱中冻存；所述恒温培养箱内的温度控制在28°C;所述LB液体培养基中添加有50mg/L Kan ;所述摇床内培养条件为温度28°C，转速 180r/mino4.根据权利要求1所述的一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法，其特征在于，步骤bl中:将虫癭多的花生根剪成Icm小段；所述NaCLO溶液的浓度为I 所述搅拌时间为 1min05.根据权利要求1所述的一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法，其特征在于，步骤c中:选取根结线虫悬液Iml或卵悬液Iml接至花生毛状根培养皿；所述盒盖静置时间为Ih ;所述培养温度为25°C，培养时间为42d。
【专利摘要】本发明公开了一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法，包括以下步骤：选取花育45号种子，接种于MSB5培养基上培养；取发根农杆菌A4菌株，经培养活化，达到对数生长期；采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花育45号花生子叶诱导毛状根；选取虫瘿多的花生根，浸没入NaCLO溶液中，弄碎，制成混合液；将混合液倒入组合筛上，组合筛自上而下依次为40目、200目、325目和500目，用无菌水喷淋冲洗，使线虫集中一侧，然后再用少量无菌水从筛背面冲洗筛上物，收集液体到容器获得根结线虫悬液；将根结线虫悬液均匀接至花生毛状根培养皿，培养获得大量虫卵和二龄幼虫。本发明方法解决了难以获得纯化的大量根结线虫的问题，繁殖率高。
【IPC分类】A01K67/033
【公开号】CN105010245
【申请号】CN201510472068
【发明人】任艳, 袁美, 石延茂, 尹亮, 李双铃, 崔潇, 李磊
【申请人】山东省花生研究所
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月4日