一种中华桫椤绿色球状体途径的组培繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明属植物组织培养技术领域，具体设及中华砂秽绿色球状体诱导和增殖方 法。 技术背景
[0002] 中华砂秽（Alsophilacostularis)隶属于砂秽科砂秽属（木砂秽属）。地上茎直 立，树状，可高达10m，是为数不多的木本藤类植物。
[0003] 砂秽科植物最早出现于中生代的早保罗纪或晚=叠纪，是恐龙同时代的物种。后 来由于地质变迁和气候变化，大量种类灭绝，最后仅存于热带和亚热带中某些气候特别适 宜的"避难所"，因此被称为植物界的"不遗植物"、"活化石"。中华砂秽W及砂秽科的所有 种均列为国家二级重点保护野生植物《国家重点保护野生植物名录（第一批）》。
[0004] 自然条件下，中华砂秽采用抱子进行繁殖，但抱子萌发和配子体发育对环境条件 的要求较为严格，导致中华砂秽的自然繁殖能力极低，加之环境破坏和人为采掘，中华砂秽 的野生种群数量急剧减少，已溯临灭绝。
[0005]目前，中华砂秽的组织培养仅局限于抱子繁殖途径，其方法主要包括：抱子培养、 原叶体培养、原叶体增殖、抱子体培养等步骤，存在繁殖周期长、繁殖效率低等缺陷，因此， 寻找一种繁殖周期短且繁育效率高的方法，对于珍惜溯危藤类一中华砂秽种群数量的扩 大，W及溯危程度的缓解具有重要意义。
[0006] 藤类植物绿色球状体是指由藤类植物外植体诱导得到的由众多绿色颗粒组成的 球状体，其本质是分生组织集合体，接种于分化培养基上可W获得大量藤类植物幼苗，一旦 诱导得到绿色球状体，其繁殖系数将显著高于抱子繁殖途径，且繁殖周期缩短。
[0007] 由于外植体选择W及适宜的植物激素筛选方面的原因，目前，已经成功诱导绿色 球状体的种类较为有限，且在绿色球状体增殖过程中，只有选择适宜的植物激素配方和培 养方式，才能在抑制绿色球状体分化的同时实现快速增殖。因此，目前，尚无中华砂秽等大 型树状木本藤类植物通过绿色球状体途径组培繁殖研究的相关报道。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是克服中华砂秽自然繁殖力低、通过抱子繁殖途径组培 繁殖周期较长，且繁殖系数较低等技术问题。
[0009]为解决上述技术问题，本发明提供一种中华砂秽绿色球状体途径的组培繁殖方 法，该方法包括W下步骤：
[0010] (1)中华砂秽无菌外植体的获得
[0011] 将中华砂秽无菌抱子接种在1/4MS+薦糖30. 0g/L+琼脂7.Og/L，pH为5. 80的培 养基上，培养条件为：20~25°C、每天的光照时间为12小时，光照强度为20001X，得到无菌 苗，在超净工作台，将无菌苗在解剖镜下用綴子剥离出茎尖，将茎尖作为中华砂秽绿色球状 体诱导的无菌外植体；
[0012] (2)中华砂秽绿色球状体的诱导
[0013] ①第一次诱导预培养：将步骤（1)获得的茎尖接种于绿色球状体诱导预培养 基I，培养5天~7天，培养条件与步骤（1)相同，所述绿色球状体诱导预培养基I为： 1/4MS~1/2MS+6-BA1. 0 ~2.Omg/L+NAA0. 2 ~0. 4mg/L++ 薦糖 30. 0g/L+ 琼脂 7.Og/L， 抑为5. 80;
[0014] ②第二次诱导预培养：将步骤（2)①第一次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状 体诱导预培养基II，培养时间为5天~7天，培养条件与步骤（1)相同，所述绿色球状体诱 导预培养基II为：1/4MS~l/2MS+2-ip0. 1 ~0. 3mg/L+NAA0. 2 ~0. 4mg/L+ 薦糖 30. 0g/L+ 琼脂7.Og/L，抑为5. 80;
[0015] ③绿色球状体的诱导：将步骤（2)②第二次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状 体诱导培养基，培养条件与步骤（1)相同，培养时间为14天~20天，得到绿色球状体，所述 绿色球状体诱导培养基为：1/4MS~l/2MS+2-ip0. 5~0. 8mg/L+NAA0. 2~0. 4mg/L+薦糖 30. 0g/L+ 琼脂 7.Og/L，抑为 5. 80;
[0016] (3)中华砂秽绿色球状体的增殖
[0017] 每一个增殖周期按W下步骤进行：
[0018] ①第一步增殖培养：将步骤（2)③获得的绿色球状体切割成1~3mm，接种于增 殖培养基A，培养21天~22天，培养条件与步骤（1)相同，所述增殖培养基A为：1/4MS~ 1/2MS+TDZ0. 8 ~1.Omg/L+NAA0. 1 ~0. 2mg/L+ 薦糖 30. 0g/L+ 琼脂 7.Og/L，抑为 5. 80;
[0019] ②第二步增殖培养：将（3)①第一步增殖培养增殖后的绿色球状体接种于增殖 培养基B，培养21天~22天，培养条件与步骤（1)相同，所述增殖培养基B为：1/4MS~ l/2MS+2-ip0. 1 ~0. 2mg/L+6-BA1. 0 ~1. 2mg/L+NAA0. 05 ~0.lmg/L+ 薦糖 30. 0g/L+ 琼 脂 7.Og/L，抑为 5. 80;
[0020] (4)中华砂秽绿色球状体的分化
[0021] 将步骤（3)②第二步增殖培养增殖后的绿色球状体分割为直径1~3mm的球状 体，接种于分化培养基，培养28天~29天，得到分化幼苗，培养条件与步骤（1)相同，所述 分化培养基为：1/6MS~1/4MS+活性炭1~2g/L+水解酪蛋白200~300mg/L+薦糖30.Og/ L+ 琼脂 7.Og/L，抑为 5. 80;
[00过 妨生根培养
[0023] 将步骤（4)得到的分化幼苗接种于生根培养基，分化幼苗生根后即为中华砂秽组 培苗，培养条件与步骤（1)相同，所述生根培养基为：1/2MS+活性炭1~2g/L+水解酪蛋白 200 ~300mg/L+ 薦糖 30. 0g/L+ 琼脂浓度 7.Og/L，抑为 5. 80。
[0024] 本发明的创新点：
[00巧]1、成功诱导出了大型树状木本藤类植物中华砂秽的绿色球状体，绿色球状体的诱 导率达82~88%。
[0026] 本发明通过大量实验，筛选出了适宜大型树状木本藤类植物中华砂秽的两个绿色 球状体诱导预培养基和一个绿色球状体诱导培养基。并设计了两次诱导预培养和一次诱导 培养步骤，成功诱导出了中华砂秽绿色球状体，并且绿色球状体的诱导率达82~88 %。
[0027] 2、增殖培养上，筛选出A和B两个增殖培养基，并设计每一个增殖周期依次用A 和B两个增殖培养基，既有效地抑制了增殖过程出现的分化现象，又取得了增殖倍数达到 7. 5~9. 3倍特别显著的技术效果，在不发生分化的前提下实现高效增殖，同时保持了较高 的增殖速率。需进行几个周期的增殖培养，可根据生产上需要的种苗数量确定。本发明在 研究过程中发现，仅采用增殖培养基A，可抑制分化，但增殖倍数较低，而仅采用增殖培养基 B，增殖倍数较高但出现分化现象，而按本发明方法所述依次用增殖培养基A和增殖培养基 B交替进行的增殖培养，既抑制了增殖过程出现的分化现象，又可实现了高效增殖的技术效 果。而且有利于中华砂秽绿色球状体作为中间繁殖体的增殖W及保存。
[0028] 通过本发明的创新，与现有技术相比，本发明具有如下益效果：
[0029] 1、成功诱导出树状木本藤类植物绿色球状体，并且繁殖效率特别高，对于我国二 级重点保护的珍惜溯危藤类一中华砂秽种群数量的扩大，W及溯危程度的缓解具有重要意 义。
[0030] 本发明方法使绿色球状体诱导率、绿色球状体增殖速率、绿色球状体分化率、单个 绿色球状分化苗数、W及分化苗培养成组培苗的效率均特别高，其绿色球状体的诱导率为 82~88%，绿色球状体的增殖倍数达7. 5~9. 3倍，绿色球状体的分化率100 %，生根率 100%，组培苗的形成率100%，因此，本发明繁殖效率特别高。而现有抱子繁殖途径的抱子 萌发率为34. 33%，原叶体簇增殖2~3倍，抱子体幼苗成苗率为24. 00%。与现有的抱子 途径繁殖相比，本发明的繁殖效率产生了预料不到的技术效果。
[0031] 2、繁殖周期短
[0032] 本发明诱导出绿色球状体后，即可W绿色球状体作为中间繁殖材料，高效培育出 大量组培苗，无需再重复从抱子开始培养，因此，繁殖周期短。W绿色球状体为中间繁殖材 料计算，繁殖周期为98天~101天，而现有的抱子途径繁殖，每次繁殖均需从抱子萌发开始 繁殖，其繁殖周期需217天~252天，本发明与常规抱子繁殖途径的繁殖方法相比缩短了 119~151天，繁殖周期缩短了 54. 8~59. 9%。
[0033] 3、实现了溯危物种种质资源的离体保存
[0034] 通过本发明提供的方法得到的中华砂秽绿色球状体W及中华砂秽组培苗可作为 种质资源进行保存，对于实现珍稀溯危藤类一中华砂秽种质资源离体保存具有重要意义。
【附图说明】
[0035] 图1是中华砂秽绿色球状体。图中的线段为比例尺，表示的长度为1mm。
[0036] 图2是开始分化的中华砂秽绿色球状体。图中的线段为比例尺，表示的长度为 IrniTi〇
[0037] 具体实施方法
[0038]W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料均为市售。W下实施例 中的定量试验，均设置=次重复实验，结果取平均值。
[0039]W下各实施例培养基的制备方法为常规方法即按培养基配方所述各组分及其含 量混合后，用抑计调抑为该培养基要求的抑值即制成。
[0040] 实施例1本发明方法
[0041] (1)中华砂秽无菌外植体的获得
[004引将中华砂秽无菌抱子接种在1/4MS+薦糖30. 0g/L+琼脂7.Og/l，抑为5. 80的培 养基上，培养条件为：20~25°C、每天的光照时间为12小时，光照强度为20001X，得到幼嫩 的无菌苗。在超净工作台中，将得到的无菌苗在解剖镜下用綴子剥离出茎尖，将茎尖作为中 华砂秽绿色球状体诱导的无菌外植体。
[0043] 中华砂秽无菌抱子的获得方法为：将lOmg抱子置于1. 5ml离屯、管中，用无菌水浸 泡1~2小时，600化/min离屯、2min，获得抱子沉淀物，加入体积分数为5%化CIO溶液灭菌 4min，无菌水清洗3-5次即得中华砂秽无菌抱子。
[0044] (2)中华砂秽绿色球状体的诱导
[0045] ①第一次诱导预培养：将步骤（1)获得的茎尖接种于绿色球状体诱导预培养基I 中，培养7天，培养条件与步骤（1)相同，所述绿色球状体诱导预培养基I为：l/4MS+6-BA 1. 5mg/L+NAA0. 2mg/L+ 薦糖 30. 0g/L+ 琼脂 7.Og/L，抑为 5. 80;接种数 50 个茎尖。
[0046] ②第二次诱导预培养：将步骤（2)①第一次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状 体诱导预培养基II中，培养时间为7天，培养条件与步骤（1)相同，所述绿色球状体诱导预 培养基II为：l/4MS+2-ip0. 3mg/L+NAA0. 2mg/L+ 薦糖 30. 0g/L+ 琼脂 7.Og/L，抑为 5. 80。
[0047] ③绿色球状体的诱导：将步骤（2)②第二次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状 体诱导培养基中，培养时间为14天，培养条件与步骤（1)相同，得绿色球状体，所述绿色球 状体诱导培养基为：l/4MS+2-ip0. 8mg/L+NAA0. 2mg/L+ 薦糖 30. 0g/L+ 琼脂 7. 0g/L，pH为 5. 80。
[0048] 经诱导预培养和诱导培养后，中华砂秽的茎尖膨大形成绿色球状体，绿色球状体 的诱导率为88. 00%。
[0049] 诱导率=(产生绿色球状体的无菌苗数/接种的无菌外植体数）X100%。