一种高效脱除柑橘碎叶病毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于相橘种植领域，具体设及一种高效脱除相橘碎叶病毒的方法。
【背景技术】
[0002] 相橘碎叶病是由相橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)引起的一种严 重病害，1962年由Wallace和Drake在美国加利福尼亚州首次发现(Wallace&Drake, 1962)， 目前在澳大利亚、日本、南非、中国等国家均有发生(Miyakawa et al.,1976;Marais et al.，1986; Zhang et al.，1988 ;Broa 化 ent et al.，1994) XTLV 主要通过机械、嫁接和汁液 摩擦传播，也可种子传播(Roistacher et al. ,1980)。它能引起积及其杂种作化木的相橘 树嫁接口不亲和，叶片黄化，严重时甚至导致整株植株死亡(Grout ,B.W.W. ,1990)。由于病 毒类病害的系统侵染性和尚无有效的治疗方法，一般应W预防为主。当前世界各国预防相 枯病毒类病害的通行做法是采用茎尖嫁接或热处理加茎尖嫁接方式对病毒进行脱除，然后 栽种无病毒苗木(Roistacher and Kitto ,1977)。早期的研究者们成功运用热处理和茎尖 嫁接相结合的方法脱除相橘碎叶病毒化〇izumi，1986;He，1993;Song et al.，1994;He et al.，1996; Zhang，1997)，但缺少针对溫度变化与CTLV含量关系的研究，实际操作中也发现 因相橘植株不耐长时间热处理导致脱毒延迟的问题。
[0003] 因此，急需一种高效脱除CTLV的方法。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种高效脱除相橘碎 叶病毒的方法。
[000引为了实现上述目的W及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明提供了一种高效脱除相橘碎叶病毒的方法，所示方法包括如下步骤：
[0007] (1)将感染了相橘碎叶病毒的相橘植株采用脉冲溫度进行热处理；
[0008] (2)采用步骤(1)中处理好的相橘植株的茎尖进行茎尖嫁接。
[0009] 优选地，步骤(1)中，所述相橘植株为奉节甜澄植株。
[0010] 进一步优选，步骤(1)中，所述相橘植株为奉节72-1厮澄植株。
[0011] 优选地，步骤（1)中，所述采用脉冲溫度进行热处理，可具体是:将感染了相橘碎 叶病毒的相橘植株先在40°C条件下处理一段时间Tl,所述Tl的范围是2~化;然后继续在25 ~30°C条件下处理一段时间T2,所述T2的范围是2~化;如此交替循环处理30~50天。更优 选，如此交替循环处理40~50天。
[0012] 进一步优选地，所述采用脉冲溫度进行热处理，可具体是:将感染了相橘碎叶病毒 的相橘植株先在40°C条件下处理一段时间Tl,所述Tl的范围是2~化;然后继续在27°C条件 下处理一段时间T2,所述T2的范围是2~化;如此交替循环处理30~50天。更优选，如此交替 循环处理40~50天。
[0013] 进一步优选地，所述采用脉冲溫度进行热处理，可具体是:将感染了相橘碎叶病毒 的相橘植株先在40°C条件下处理一段时间Tl,所述Tl的范围是2~化;然后继续在25°C条件 下处理一段时间T2,所述T2的范围是2~化;如此交替循环处理30~50天。更优选，如此交替 循环处理40~50天。
[0014] 进一步优选地，所述采用脉冲溫度进行热处理，可具体是:将感染了相橘碎叶病毒 的相橘植株先在40°C条件下处理一段时间Tl,所述Tl的范围是2~化;然后继续在30°C条件 下处理一段时间T2,所述T2的范围是2~化;如此交替循环处理30~50天。更优选，如此交替 循环处理40~50天。
[0015] 进一步优选地，上述所述Tl的范围是4h;所述T2的范围是4h。
[0016] 本发明的优选实施例中，将感染了相橘碎叶病毒的相橘植株先在40°C条件下处理 一段时间Tl,所述Tl的范围是4h;然后继续在27°C条件下处理一段时间T2,所述T2的范围是 4h;如此交替循环处理40~50天。
[0017] 本发明的优选实施例中，将感染了相橘碎叶病毒的相橘植株先在40°C条件下处理 一段时间Tl,所述Tl的范围是4h;然后继续在25°C条件下处理一段时间T2,所述T2的范围是 地;如此交替循环处理50天。
[0018] 本发明的优选实施例中，将感染了相橘碎叶病毒的相橘植株先在40°C条件下处理 一段时间Tl,所述Tl的范围是4h;然后继续在30°C条件下处理一段时间T2,所述T2的范围是 地;如此交替循环处理40天。
[0019] 优选地，步骤(2)中，所采用的茎尖包含2~3个W上的叶原基。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0021] (1)传统高溫热处理相枯植株不能正常生长，常常导致植株热伤害，萌发无毒化嫩 芽数量少;而本发明的技术方案在维持溫度处理植株正常生长的情况下萌发更多数量的无 毒化嫩芽茎尖。
[0022] (2)具体的，本发明W奉节甜澄植株为对象，设计两种短时间变溫处理条件(40°C 4h/25°C4h和40°C4h/30°C4h)，W常规热处理条件(40°C10h/30°C14h)作为对照，利用实时 巧光定量RT-PCR检测CTLV含量，采用茎尖嫁接技术进行脱毒，研究短时间变溫处理对CTLV 脱毒的影响。结果显示两种处理甜澄植株30d后嫩芽萌发速度明显快于对照，萌芽率也比对 照高;40°C4h/25°C4h处理甜澄植株50d时茎尖苗脱毒率达60 %，40°C4h/30°C4h处理甜澄植 株4(M时茎尖苗脱毒率达71.43%，常规热处理甜澄植株3(W时没有获得脱毒茎尖苗，由此表 明两种短时间变溫处理具有加快脱除CTLV的作用。
【附图说明】
[0023] 图1:变溫处理甜澄嫩芽前五叶中CTLV和18s RNA的烙解曲线图。
[0024] 图2.1:常规热处理(40°C 10h/30°C 1地)处理30d嫩芽的前五叶CTLV相对表达量。 [002引图2.2:40°C4h/25°C4h处理30d和50d甜澄植株嫩芽的前五叶CTLV相对表达量，该 变溫条件处理30d和5(W时分别取每个嫩芽前五叶各部位样品9个和5个，30d和50d分别取紧 靠嫩芽的老叶样品7个和4个。
[0026] 图2.3:40°C4h/30°C地处理30d和40d嫩芽前五叶CTLV相对表达量。
[0027] 图2.4:40°(31011/30°(31地、40°0地/25°0地和40°0地/30°0地处理甜澄植株嫩芽前 五叶的碎叶病毒相对表达量比较，其中，40°C10h/25°Cl地变溫处理30天，40°C4h/25°C地变 溫处理30天和50天，40°C4h/30°C4h变溫条件处理30天和40天时分别取每个嫩芽前五叶各 部位样品4个，9个和5个，10个和5个，分别取紧靠嫩芽的老叶样品4个，7个和4个，3个和3个。 运巧巾溫度处理下，第一片叶到第五片叶CTLV含量为0的样品数分别是33，28，25，23，19，在 40°C4h/25°C4h溫度条件处理50天，40°C4h/30°C4h溫度条件处理30天和40°C4h/25°C4h溫 度条件处理40天时各有1个紧靠嫩芽的老叶未检测到CTLV。
[0028] 图2.5:变溫条件处理下茎尖苗。
[0029] 图2.6:变溫条件处理茎尖苗脱毒率检测。
【具体实施方式】
[0030] 本发明的主要的创新点在于:将感染相枯碎叶病毒植株放置于脉冲溫度处理条件 下，利用实时定量PCR方法监测感病相枯植株中病毒含量。脉冲溫度处理指根据需要将溫度 处理程序设置成不同溫度高低和不同时间长短变化，类似脉冲变化的程序处理。脉冲溫度 处理程序中高溫为具有纯化碎叶病毒繁殖的效应，低溫为适合相枯植株正常生长的溫度， 采用实时定量PCR方法监测获得合适的脉冲溫度处理条件，W达到运样的效果:高溫期使得 相枯植株中的碎叶病毒被纯化而繁殖力很低，维持到尚未造成相枯植株热伤害时转入低溫 期，低溫期相枯植株能够正常生长萌发嫩芽，维持到碎叶病毒繁殖活性尚未恢复时又转入 高溫期，如此交替循环处理，使得碎叶病毒在相枯植株体内一直处于很低含量水平和几乎 没有繁殖力状态，而相枯植株可正常生长萌芽，明显提高所萌发嫩梢茎尖数量和无毒化率， 进一步利用茎尖嫁接方法获得无毒的茎尖苗。
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