一种红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于诱导再生技术领域，尤其涉及一种红花百里香无菌苗诱导再生植株的 方法。
【背景技术】
[0002] 红花百里香(Thymus serpyllum L.)属于唇形科百里香属，莖叶有香味，其莖株耐 干旱、免修剪，作为园林绿化植物，其应用前景广阔。用其植株提取的百里香精油，能够有效 的抑制霉菌和微生物的生长，并且能够缓解神经紧张感，在食品、化工领域均有很大用途。 百里香精油是最强劲的抗菌剂之一，具有抗菌、消炎止痛、抗肿瘤、抗氧化、防止血栓形成及 减缓身体器官组织衰老等重要的药用价值，可用于预防和治疗人类的疾病，并具有强烈的 抗真菌活性和高效防腐性，对昆虫包括蚊子也具有祛除的功效。另外，百里香提取物还具有 化感作用，有望成为新型的生物除草剂。总之，百里香精油一直是精油中的精品，在医药、食 品加工、化妆品、精细化工及日常生活中被广泛应用。百里香精油潜在的应用价值：百里香 精油对霉菌有良好的抑制作用，可以作为湿度较大地区人们家居之用。研究表明低浓度的 百里香精油和百里酚就能够对发霉的墙壁进行消毒，并能够持久的抑制潮湿居所内的真菌 生长(Klaric，K 〇salec et al.2007)。在地中海沿岸国家，尤其是希腊和埃及等国人民喜欢 使用百里香作为香辛调料。百里香精油可以刺激白细胞增殖，提升人体免疫系统 (Elhabazi，Dicko et al.2006)，在治疗人免疫缺陷如癌症、白血病和AIDS方面有巨大的应 用潜力。百里香加入香薰炉中使用，百里香可强化肺脏，对支气管炎很有帮助对呼吸系统感 染者也特别有益，并可舒缓压力，消除神经性疼痛;百里香精油的主要成份一一百里酚具有 抗血小板凝集的功能，可以作为抗血栓和血管硬化的药物（Okazaki，Kawazoe et al. 2002)。百里香还能强化神经，活化脑细胞，能提高记忆力和注意力。也能提振低落的情 绪、筋疲力竭的感觉、以及挫败的沮丧感。目前，虽然关于百里香属植物的组织培养和快速 繁殖技术研究有一些，其种类主要集中于普通百里香、东北百里香，有关于红花百里香 (Thymus serpyllum L.)的组培技术未见报道。
【发明内容】
[0003] 针对上述技术缺陷，本发明提供了一种红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：一种红花百里香无菌苗诱导再 生植株的方法，包括如下步骤：
[0005] S1.无菌苗的获取:取红花百里香种子包裹在纱布中，放入培育瓶，先用酒精浸泡 消毒，再用无菌水冲洗后放入次氯酸钠溶液浸泡3±lmin，最后用无菌水再次冲洗，消毒后 的种子接种到1/2MS培养基得红花百里香无菌苗；
[0006] S2.不定芽的诱导分化：选取培养30 ±2天的红花百里香无菌苗，将其切成3 ± 0.5cm且带有腋芽的茎段，接种到MS培养基中，进行不定芽诱导培养，28±2天后，茎段周围 已经生成不定芽；
[0007] S3.不定芽的增殖培养:红花百里香不定芽生长到2 ±0.2cm时，将不定芽切分为每 丛3-4个芽，转接到调整的MS培养基进行不定芽增殖培养；
[0008] S4.不定芽的生根培养及幼苗移栽:在红花百里香不定芽长到4cm以上时，将其切 成3 ± 0.2cm左右的茎段，接种到不定芽生根MS培养基上，诱导生根，在第15 ±1天开始萌动 生长出小根，30±2天生根数达到8±1，当根长到3cm以上时进行移栽。
[0009] 进一步:在上述红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法，所述MS培养基分为大量 元素、微量元素、铁盐和有机溶液四种母液的组合，如表1所述。在S1中的1/2MS培养基，在表 1的基础上，大量元素减半其余元素不变的MS培养基。所述MS培养基还包括在母液中增加3 ±0.3%蔗糖和0.8±0.05%琼脂粉，调节pH=5.8±0.5;MS培养基在121°C高压灭菌锅中灭 菌20 ± lmin，培养温度为25 ± 2°C，光照度2000-25001x，光照周期12 ± lh/d。
[0010] 再进一步：在上述红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法，S1酒精浓度为70%-75%，次氯酸钠溶液的活性氯含量为10% ± 1 %。
[0011] S2的MS培养基中，还加入细胞分裂激素6 - BA和植物生长素萘乙酸NAA，加入后细 胞分裂激素6 - BA浓度是0. lmg/L-0.6mg/L，植物生长素萘乙酸NAA浓度是0. lmg/L-0.3mg/ L，且细胞分裂激素6 - BA和萘乙酸NAA需要在MS培养基灭菌前加入;优选的细胞分裂激素 6-BA浓度是O.lmg/L，植物激素生长素萘乙酸NAA浓度是0.3mg/L。
[0012] S3调整的MS培养基是指MS基本配方中大量元素（1、3/4、1/2、1/4、0)和微量元素 (1、3/4、1/2、1/4、0)配比如表2所示13培养基是一种基本培养基，为了配制和使用方便，本 领域技术人员把这种培养基的19中成分又分为4大类，即铁盐和有机溶液两种母液取用量 不变，大量元素和微量元素取用量分别设置3/4、1/2、1/4、0，如表2的所示。优选的53调整的 MS培养基，还加入细胞分裂激素6 - BA和植物生长素萘乙酸NAA，加入后细胞分裂激素6 - BA 浓度是0. lmg/L，植物生长素萘乙酸NAA浓度是0.3mg/L，且细胞分裂激素6-BA和萘乙酸NAA 需要在MS培养基灭菌前加入。
[0013] S4不定芽生根MS培养基，还加入植物生长素萘乙酸NAA，加入后萘乙酸NAA浓度小 于或等于1.5mg/L，且萘乙酸NAA需要在MS培养基灭菌前加入，优选的植物生长素萘乙酸NAA 的浓度是l.〇mg/L。
[0014] S4移栽前先将培育瓶瓶盖打开，保持湿润放置2d，取出小苗，用自来水冲去附着在 根上的培养基，将小苗移栽到已灭菌的培养基质中，浸透水后放入人工温室培养。
[0015] 本发明中，6_BA:6_ 苄基腺噪呤6-Benzylaminopurine;NAA:萘乙酸 Naphthylacetic acid;MS:Murashige和Skoog培养基
[0016]与现有技术相比，本发明红花百里香(Thymus serpyllum L.)再生体系的建立，在 不定芽的诱导分化期，培养30 ±2天的红花百里香无菌苗进行不定芽诱导培养，其诱导率最 高可达94%，并且不定芽的生长状况良好。将红花百里香不定芽接种到增殖培养基中，其增 殖系数最高达到39.90±1.72,不定芽的茎较粗、颜色泛绿。不定芽的生根培养及幼苗移栽， 在第15天开始萌动生长出小根，30天平均生根数达到8.0 ± 1，生根率为100 %，将小苗移栽 到已灭菌的培养基质中，浸透水后放入人工温室培养，成活率为90%。
【具体实施方式】
[0017]下面以具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形 式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和 设备。
[0018] 1.无菌苗的获取
[0019] 取300粒饱满的红花百里香种子包裹在纱布中，放入三角瓶，先用75%酒精浸泡 30s消毒，