一种结合瓶外生根技术的羽扇豆“画廊”叶片快繁方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种羽扇豆“画廊”叶片快速诱导再生植株的方法，属花卉组织培养技术领域。
【背景技术】
[0002]羽扇豆(Lupins polyphyllus Lindl)属豆科蝶形花亚科羽扇豆属一年至多年生草本植物，俗称鲁冰花，因其赋予特殊的寓意一中国的母亲花，而得到人们的加倍钟爱。“画廊”是市场上培育的早花羽扇豆品种，有粉红色、红色、白色、黄色、蓝色及混色等花色系列，株形紧凑、叶片茂盛，株高40?50 cm，也是非常优秀的矮生盆栽品种，它的出现使羽扇豆有机会从园林应用中走进普通家庭。
[0003]羽扇豆“画廊”以种子繁殖为主，但因羽扇豆为自花授粉植物，种子繁殖系数低，种子以进口为主，相应成本占生产成本的30%，且时间和数量上很难保证，优质种苗生产成为制约羽扇豆“画廊”在我国推广的瓶颈。目前，以进口种子为外植体进行羽扇豆“画廊”组织培养快繁的技术仍不够成熟，种苗难以供应;另外，在栽培生产过程中通过自然筛选或育种选育的优良羽扇豆“画廊”单株，因其结实率非常低，其优良性状很难遗传给后代，良种推广严重受阻。因此，结合瓶外生根技术进行羽扇豆“画廊”叶片离体快繁，不仅可以解决种苗供需矛盾，降低生产成本，也可以对筛选的优良单株进行无性繁殖，保存其优良性状，对羽扇豆良种选育和培育工作具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的问题是羽扇豆“画廊”种苗供需矛盾和优良单株无性繁殖问题，为生产提供一种可周年生产的低成本羽扇豆“画廊”优质种苗快速繁殖及优良单株遗传性状高效保存的方法。
[0005]本发明的技术方案是，一种结合瓶外生根技术的羽扇豆“画廊”叶片快繁方法，包括叶片处理、愈伤组织诱导、分化培养、增殖培养与再分化、瓶外生根培养及移栽定植步骤，其特征在于，所述方法步骤为:
(1)剪下离叶尖2/3的幼嫩叶片，用流水冲洗30min，通过主脉横切成I cm宽的片状;在超净工作台上，先用75%酒精消毒1s，无菌水漂洗2次;再用10%的NaOCl磁力搅拌5 min，无菌水漂洗5次;然后用0.1%的升汞溶液消毒3 min，无菌水漂洗5次;最后用无菌滤纸吸干叶片表面水分;切断叶缘，以横切主脉的形式切成3 mmX3 mm块状，并在主脉上横切2?3个切P;
(2)将处理好的叶片背面朝下接种到愈伤组织诱导培养基MS+6-BA0.5mg/L+ZT1.0mg/L+PVP 5.0mg/L+VC 1.0mg/L上;接种后先在22°C的恒温恒湿培养箱中进行暗培养15d;再进行光照培养，15?20d产生黄绿色疏松透明的愈伤组织；
其中，MS是培养基(Murashige & Skoog Medium)，6_BA是6_苄氨基嘌呤，ZT是玉米素，PVP是聚乙烯吡咯烷酮，VC是抗坏血酸； (3)当愈伤组织长到Imm或稍大些时，及时转移到分化培养基MS+6-BA 0.8 mg/L+ZT
0.6mg/L+IAA 0.2 mg/L+水解酪蛋白(CH)300mg/L+PVP 5.0mg/L+ VC I.0mg/L上；继续光照培养，20?25d形成浅绿色质地致密的愈伤组织，并在愈伤组织上分化出绿色芽点；
其中，MS是培养基(Murashige & Skoog Medium)，6_BA是6_苄氨基嘌呤，ZT是玉米素，IAA是3-吲哚乙酸，PVP是聚乙烯吡咯烷酮，VC是抗坏血酸；
(4)切下愈伤组织上生长的绿色芽点，接种到增殖与再分化诱导培养基MS+6-BA1.5mg/L+NAA 0.25 mg/L+AC 2.0 g/L+GA3 1.0 mg/L上;继续光照培养，25?30 d可分化出健康丛生芽；
其中，MS是培养基(Murashige & Skoog Medium)，6_BA是6-苄氨基嘌呤，NAA是α-萘乙酸，AC是活性炭，GA3是赤霉素；
(5)将产生的2?3cm健康单个芽切下，先在生根液中浸泡3min，再扦插至装有营养基质的育苗袋后置于温室大棚;扦插后的15d内大棚相对空气湿度保持在85%以上，温度控制在15°C?25°C;扦插20d后，每1d用y2MS大量元素母液作为肥料进行喷洒一次，连续喷洒3次;育苗袋为无底蜂窝育苗袋，规格是8cm X 13cm X 350孔;营养基质的体积比是腐叶土:红壤土:骨粉=6:2:2;营养基质事先充分暴晒后，用1000倍甲基托布津消毒，薄膜覆盖，7d后扦插;20d可见明显生根，30?35d可见新芽生出，50d后即可移栽定植；
(6)将步骤(5)生长良好的幼苗进行定植，营养钵规格为25cmX 20cm，营养土按体积比为表层田土:泥炭土=5:2比例混合均匀;栽种选择下午进行，及时浇灌封口水，连续3天注意保持土壤湿润。
[0006]所述步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)的培养基中白砂糖45 g/L，琼脂6g/L，pH值为5.8?5.9。
[0007]所述步骤(2)和步骤(3)，光照培养的光照强度2000?2500Lux，每天光照12h，培养温度为(22 ±2) °C。
[0008]所述步骤(4)，光照培养的光照强度3000?3500 Lux，每天光照14 h，培养温度为(22±2)°C。
[0009]所述生根液为NAA 300 mg/L+VBi 0.15g/L，其中，IAA是3-吲哚乙酸，￥8!是维生素Bi0
[0010]本发明的有益效果是，本发明采用羽扇豆“画廊”叶片获得愈伤组织，再通过增殖培养与再分化获得丛生芽，进而结合瓶外生根技术获得完整植株的方法。叶片污染率小于5%，愈伤组织诱导率为72.8%，愈伤组织呈黄绿色疏松透明状;芽分化率为79.5%，分化时间短;分化健康丛生芽数量多，增殖与再分化率为83.6%;瓶外生根成活率为85.3%，根系短而粗壮，移栽成活率为92.5%。本发明可快速进行羽扇豆“画廊”种苗规模化生产，及优良单株遗传性状高效保存，有利于羽扇豆“画廊”的推广种植。
[0011]本发明适用于羽扇豆“画廊”工厂化种苗培育及优良单株遗传性状保存。
【附图说明】
[0012]图1为一种结合瓶外生根技术的羽扇豆“画廊”叶片快繁方法流程图。
【具体实施方式】
[0013]实施例1
本实例以愈伤组织诱导与分化培养基中不添加细胞分裂素ZT，以及愈伤组织诱导培养不经过暗培养为对照，包括以下步骤:
1、叶片处理:剪下离叶尖2/3的幼嫩叶片，用流水冲洗30 min，通过主脉横切成I cm宽的片状。在超净工作台上，先用75%酒精消毒10 S，无菌水漂洗2次;再用10%的NaOCl磁力搅拌5 min，无菌水漂洗5次;然后用0.1%的升萊溶液消毒3 min，无菌水漂洗5次;最后用无菌滤纸吸干叶片表面水分。切断叶缘，以横切主脉的形式切成3 mmX3 mm块状，并在主脉上横切2?3个切口。
[0014]2、愈伤组织诱导:将处理好的叶片背面朝下接种到培养基MS+6-BA 0.5mg/L+ZT1.0mg/L +PVP 5.0mg/L+VC I.0mg/L 上，培养基中白砂糖 45 g/L，琼脂 6 g/L，pH 值为 5.8 ?5.9。接种后先在22°C的恒温恒湿培养箱中进行暗培养15 d;再进行光照培养15?20 d，光照强度2000?2500 Lux，每天光照12 11，培养温度(22±2)°(:。
[0015]对照叶片接种到培养基MS+6-BA0.5mg/L+PVP 5.0mg/L+VC I.0mg/L上培养30?35 d。培养基中白砂糖45 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8?5.9。此期间内，培养温度(22±2)°C，光照强度2000?2500 Lux，每天光照12 h。
[0016]3、分化培养:当愈伤组织长到I mm或稍大些时，及时转移到分化培养基MS+6-BA0.8 mg/L+ZT 0.6mg/L+IAA 0.2 mg/L+水解酪蛋白(CH)300mg/L + PVP 5.0mg/L+VC1.0mg/L上培养20?25 d。培养基中白砂糖45 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8?5.9。此期间内，培养温度(22±2)°C，光照强度2000?2500 Lux，每天光照12 h。
[0017]对照愈伤组织及时转移到分化培养基MS+6-BA 0.8 mg/L+IAA 0.2 mg/L+水解酪蛋白(CH)300mg/L + PVP 5.0mg/L+VC 1.0mg/L 上。
[0018]4、增殖培养与再分化:切下愈伤组织上生长的绿色芽点，接种到增殖与再分化诱导培养基MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.25mg/L+AC 2.0g/L+GA3 I.0mg/L上培养25?30 d。培养基中白砂糖45 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8?5.9。此期间内，培养温度(22 ± 2) °C，光照强度3000?3500 Lux，每天光照 14 h。
[0019]5、瓶外生根培养:将2?3 cm的健康单个芽切下，先在生根液(NAA 300 mg/L+VBi
0.15 g/L)中浸泡3 min，再扦插至装有营养基质的育苗袋后置于温室大棚。扦插后的15 d内大棚相对空气湿度保持在85%以上，温度控制在15°C?25°C。扦插20 d后，每10天用y2MS大量元素母液作为肥料进行喷洒一次，连续喷洒3次。育苗袋为无底蜂窝育苗袋，规格是8 cmX 13cm X 350孔。营养基质的体积比是腐叶土:红壤土:骨粉=6: 2:2，营养基质事先充分暴晒后，用1000倍甲基托布津消毒，薄膜覆盖，7 d后扦插。
[0020]6、移栽定植:将生长良好的幼苗进行定植，营养钵规格为25 cmX 20 cm，营养土按体积比为表层田土:泥炭土=5:2比例混合均匀。栽种选择下午进行，及时浇灌封口水，连续3天注意保持土壤湿润。
[0021 ] 7、试验处理愈伤组织诱导率72.8%，芽分化率79.5%，增殖与再分化率83.6%。对照愈伤组织诱导率45.6%，芽分化率64.5%，增殖与再分化率77.2%。
[0022]实施例2
本实例以增殖与再分化培养基中添加不同浓度的6-BA和NAA为对照，包括以下步骤:
1、叶片处理:剪下离叶尖2/3的幼嫩叶片，用流水冲洗30 min，通过主脉横切成I cm宽的片状。在超净工作台上，先用75%酒精消毒10 S，无菌水漂洗2次;再用10%的NaOCl磁力搅拌5 min，无菌水漂洗5次;然后用0.1%的升萊溶液消毒3 min，无菌水漂洗5次;最后用无菌滤纸吸干叶片表面水分。切断叶缘，以横切主脉的形式切成3 mmX3 mm块状，并在主脉上横切2?3个切口。
[0023]2、愈伤组织诱导:将处理好的叶片背面朝下接种到培养基MS+6-BA 0.5mg/L+ZT1.0mg/L +PVP 5.0mg/L+VC I.0mg/L 上，培养基中白砂糖 45 g/L，琼脂 6 g/L